目的应用组织芯片技术和免疫组织化学方法检测VEGF及VEGFR-1、VEGFR-2、VEGF-C及VEGFR-3和CD133在胃癌组织中的表达,应用抗CD34和D2-40抗体标记微血管和微淋巴管进而评估微血管/微淋巴管密度,分析它们与胃癌临床病理因素之间的关系,阐释VEGF及VEGFR-1、VEGFR-2、VEGF-C及VEGFR-3在胃癌侵袭、转移过程中的作用及意义;比较分析VEGF、VEGFR-1、VEGFR-2、MVD、VEGF-C、VEGFR-3、MLVD表达的关系,探讨胃癌微血管/微淋巴管生成在胃癌发生发展中的相互关系及意义。材料与方法1、临床病例资料收集中国医科大学附属第一医院和辽宁省肿瘤医院外科手术切除胃癌标本208例,所有病例均经病理诊断证实。其中男140例,女68例;年龄20～80岁,中位年龄60岁。每例均取原发灶胃癌组织,配对远癌正常胃黏膜139例。208例胃癌中高、中分化96例,低分化112例。组织学分型:管状腺癌157例,黏液腺癌26例,印戒细胞癌19例,乳头状腺癌3例,未分化癌3例。临床病理分期:早期胃癌30例,进展期胃癌178例。浸润深度未累及浆膜33例,累及浆膜175例。伴淋巴结转移156例,无淋巴结转移52例。21例伴远端脏器转移,187例无远端脏器转移。所有患者术前均未做放、化疗,临床病理资料完整。2、实验方法采用组织芯片技术和PV-9000二步免疫组织化学染色方法,观察VEGF及VEGFR-1、VEGFR-2、CD34、VEGF-C及VEGFR-3、D2-40、CD133在胃癌组织中的表达,分析它们表达之间的相互关系及临床病理学意义。3、结果判定VEGF及VEGFR-1、VEGFR-2、VEGF-C及VEGFR-3主要在细胞浆表达;CD133主要表达于细胞浆和细胞膜;CD34表达于血管内皮细胞;D2-40表达于淋巴管内皮细胞。免疫组化结果由两位观察者采用盲法每个病例随机选择2个有代表性的高倍视野,计数200个细胞,按照阳性细胞数占同类细胞数的比例,进行等级评分。结果采用半定量计分法判定,以染色强度与阳性细胞的百分比的乘积作为半定量标准。即A:按阳性着色程度评分,0分为无色;1分为黄色;2分为棕黄色;3分为棕褐色(深浅与背景色相对比)。B:按阳性细胞所占比例评分,0分:≤5%;1分:6%～25%;2分:26%～50%;3分:51%～75%;4分:＞75%。两者乘积:0分为阴性(-);1～4分为弱阳性(+);5～8分为中度阳性(++);9～12分为强阳性(+++)。CD133选择2个有代表性的高倍视野,计数每100个同类细胞中阳性细胞数,进行均数比较。棕黄色的内皮细胞或内皮细胞簇为一个血管计数,微血管密度(MVD)计数采用Weidner最高血管密度计数法,每例首先在低倍镜下确定3个血管着色最密集的区域,即“热点”(Hot Spots)。然后在400倍光镜下计数3个视野内血管数,取其平均值,作为该组织的MVD,对管腔直径大于8个红细胞或管壁有平滑肌存在的脉管均不计数。微淋巴管密度(MLVD)计数方法同MVD计数方法相同。4、统计分析所有样本用SPSS13.0统计软件包进行统计学处理,计量资料用((?)±s)表示,进行t检验和单向方差(One-Way ANOVA)分析。计数资料用x~2检验及Kendall’stau-b相关分析,以P＜0.05为差异有统计学意义。结果1、胃癌组织中VEGF及VEGFR-1、VEGFR-2的表达(VEGF:73.6%,153/208;VEGFR-1:59.1%,123/208;VEGFR-2:64.9%,135/208)明显高于正常胃黏膜组织(VEGF:17.3%,24/139;VEGFR-1:33.1%,46/139:VEGFR-2:23.0%,32/139;P＜0.01);VEGF、VEGFR-1、VEGFR-2表达在肿瘤浸润深度透浆膜组(VEGF:77.1%,135/175;VEGFR-1:62.9%,110/175;VEGFR-2:69.7%,122/175)显著高于浸润深度未及浆膜组(VEGF:54.5%,18/33;VEGFR-1:39.4%,13/33;VEGFR-2:39.4%,13/33;P＜0.05);在伴淋巴转移组(VEGF:78.8%,123/156;VEGFR-1:64.7%,101/156;VEGFR-2:71.8%,112/156)表达显著高于无淋巴转移组(VEGF:57.7%,30/52;VEGFR-1:42.3%,22/52;VEGFR-2:44.2%,23/52:P＜0.01);而与患者性别、年龄、Borrmann分型、临床分期、分化程度、组织学类型和脏器转移无显著性差异(P＞0.05)。2、胃癌组微血管密度(MVD)较正常胃黏膜组MVD显著增高(26.19±16.23vs 16.02±9.88,P＜0.01)。MVD在Borrmann分型中Ⅲ～Ⅳ显著高于Ⅰ～Ⅱ(27.90±15.50 vs 18.31±17.56,P＜0.01);进展期胃癌明显高于早期胃癌(27.75±15.37vs 16.97±18.52,P＜0.01);低分化程度高于高中分化程度(28.63±14.51 vs 24.11±17.42,P＜0.05);淋巴转移组显著高于无淋巴结转移组(27.29±16.33 vs 19.25±14.14,P＜0.01);与患者性别、年龄、组织学类型、浸润深度及脏器转移无显著性差异(P＞0.05)。3、胃癌组织中VEGF-C及VEGFR-3的表达(VEGF-C:62.5%,130/208;VEGFR-3:72.6%,151/208)明显高于正常胃黏膜组织(VEGF-C:6.5%,9/139;VEGFR-3:6.5%,9/139;P＜0.01);胃癌组织中VEGF-C表达水平在伴淋巴结转移组(68.6%,107/156)显著高于无淋巴结转移组(44.2%,23/52;P＜0.01);VEGF-C在肿瘤浸润深度透浆膜组(67.4%,118/175)显著高于浸润深度未及浆膜组(36.4%,12/33;P＜0.01);而与患者性别、年龄、Borrmann分型、临床分期、分化程度、组织学类型和脏器转移无显著差异(P＞0.05)。胃癌组织中VEGFR-3表达水平在高中分化程度(78.1%,75/96)高于低分化程度(67.9%,76/112;P＜0.01);在有淋巴结转移组患者的表达水平(76.9%,120/156)高于无淋巴结转移组(59.6%,31/52;P＜0.05);而与患者性别、年龄、Borrmann分型、临床分期、组织学类型、浸润深度和脏器转移无显著差异(P＞0.05)。4、胃癌组微淋巴管密度(MLVD)和正常胃黏膜组织MLVD(9.41±9.32 vs7.70±7.69,P＞0.05)无明显差异;而在胃癌淋巴结转移组中MLVD(9.81±9.97)高于无淋巴转移组(6.41±7.85,P＜0.01);而在性别、年龄、Borrmann分型、临床分期、分化程度、组织学类型、浸润深度、和脏器转移组中MLVD无显著差异(P＞0.05)。5、应用组织微阵列技术和免疫组织化学方法,检测干细胞标记物CD133在65例胃癌及其配对正常胃黏膜组织中的表达,计数阳性细胞个数,进行统计结果分析。结果显示在正常胃黏膜上皮细胞中CD133阳性细胞数(0.56±1.56)高于胃癌组织中CD133阳性细胞数(0.14±0.73,P＜0.05)。同时,显微镜下还观察到少数固有膜中的单核细胞和血管内皮细胞的细胞浆和细胞膜呈阳性着色;正常胃固有膜中CD133阳性之单核细胞数(1.28±1.37)和胃癌间质中CD133阳性之单核细胞数(1.35±1.98)分别高于正常胃黏膜上皮细胞中(0.56±1.56)和胃癌组织中(0.14±0.73)CD133阳性细胞数;在正常胃固有膜中CD133阳性之单核细胞和胃癌间质中CD133阳性之单核细胞之间无显著性差异(P＞0005)。胃癌组织中CD133阳性细胞数与胃癌组织学类型相关(F=3.315,P＜0.05);在胃癌间质中CD133阳性单核细胞数与胃癌Borrmann分型相关,Ⅲ-Ⅳ(1.57±2.09)高于Ⅰ～Ⅱ(0.27±0.65,t=0.375,P＜0.05)。6、在VEGF高表达的区域,VEGFR-1和VEGFR-2的表达亦增强;VEGF与VEGFR-1、VEGFR-2呈正相关趋势(VEGFR-1:r_k=0.131,P＜0.05;VEGFR-2:r_k=0.178,P＜0.01)。VEGFR-1在胃癌组织中的表达与VEGFR-2的表达呈正相关(r_k=0.423,P＜0.01)。胃癌组织中MVD与VEGF、VEGFR-1和VEGFR-2的表达呈不相关趋势(P＞0.05)。在胃癌组织中VEGF-C高表达与VEGFR-3的表达呈正相关(r_k=0.334,P＜0.01)。MLVD在胃癌组织中的分布和数量与VEGF-C和VEGFR-3表达呈正相关(P＜0.05)。结论1、VEGF及VEGFR-1、VEGFR-2在胃癌组织中广泛表达,与胃癌患者的临床病理特征和微血管生成关系密切。胃癌组织中VEGF的表达与VEGFR-1、VEGFR-2的表达呈正相关;VEGFR-1在胃癌组织中的表达与VEGFR-2的表达呈正相关。这些结果都提示VEGF、VEGFR-1、VEGFR-2在胃癌组织的血管生成和侵袭转移过程中可能起重要作用,直接或间接参与了胃癌新生血管的形成,为胃癌的生长提供了必须的养料和清除代谢产物,促进了胃癌侵袭转移过程的发生和发展。2、VEGF-C在胃癌组织中的高表达与胃癌浸润深度、淋巴转移密切相关;胃癌组织中VEGFR-3的表达与胃癌组织分化程度、淋巴转移密切相关。同时,在胃癌组织中VEGF-C高表达与VEGFR-3的表达呈正相关。MLVD在胃癌组织中的分布和数量与VEGF-C和VEGFR-3表达呈正相关。以上结果提示VEGF-C、VEGFR-3在肿瘤组织淋巴管生成和淋巴转移中可能起重要作用。VEGF-C通过与受体结合诱导肿瘤新生微淋巴管形成,直接或间接促进了肿瘤淋巴转移,加速了肿瘤侵袭转移的发生和发展的演进过程。3、本研究应用组织微阵列技术,检测发现CD133阳性细胞数在正常胃黏膜上皮细胞中略高于在胃癌中;胃癌间质中的单核细胞和血管内皮细胞的细胞膜和细胞浆也呈阳性着色,且胃癌间质中CD133阳性之单核细胞数高于正常胃黏膜上皮细胞和胃癌细胞中的表达数量。CD133的表达与胃癌的组织学类型相关;胃癌间质中CD133阳性单核细胞数在BorrmannⅢ～Ⅳ中高于Ⅰ～Ⅱ型。以上结果提示,在病理状态下CD133阳性之骨髓来源细胞在胃黏膜癌变演进过程中募集至胃黏膜癌变起始部位,促进了胃癌的发生和侵袭转移;也可能参与了肿瘤微血管/微淋巴管形成和发展的过程。用组织微阵列技术检测评价CD133作为胃癌干细胞标记物方面具有一定的局限性,这可能与组织微阵列穿取的病变组织柱微小(直径大约为1mm),不能全面观察病变组织整体水平有关。因此也提示组织微阵列技术虽然具备高通量、灵活性和节约性等多方面的优点,但是作为一种技术手段用来检测干细胞标记物可能仍具有一定的局限性。