糖尿病(Diabetes mellitus, DM)是一组以高血糖为特征的代谢性疾病。机体血糖增高是由于胰岛素分泌缺陷、生物作用受损或两者协同作用所致。血糖水平增高可导致机体各种组织,特别是眼、肾、心脏、血管、神经的慢性损害与功能障碍。1型糖尿病(DM1)多发于儿童和青少年,表现为患者体内胰岛素绝对不足,必须依赖外源性胰岛素降低血糖。1948年Albright和Reifenstein首次提出了糖尿病型骨质疏松症(Diabetic Osteoporosis,DOP)这一概念,明确指出糖尿病患者血糖长期控制不良容易发生骨质疏松。糖尿病型骨质疏松症是指在糖尿病基础上并发骨量减少,骨脆性增加,骨显微结构受损的全身代谢性骨病。众所周知,骨组织的改建与成熟主要由骨形成和骨吸收两个过程不停地循环交替来完成。研究表明,DM1主要导致骨形成降低。骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cells, MSCs)具有成骨分化和成脂分化的能力。成骨分化受到众多信号通路及相关转录调控因子的影响,其中Nfic为核因子I(Nuclear factor-1, Nfi)家族的四个成员之一,过表达的Nfic可促使成骨细胞分化增加,新骨形成。此外,Nfic也可通过抑制过氧化物酶体增殖物激活受体Y (peroxisome proliferator-activated receptor gamma, PPARγ)的表达,抑制BMSCs的成脂分化,显示出与年龄及激素水平相关的骨质疏松症样的表型。本实验主要研究：1、1型糖尿病大鼠模型建立及首次建模失败后的补救措施及其效果；2、糖尿病大鼠模型胰腺组织学改变及模型的稳定性；3、1型糖尿病大鼠Nfic与其它成骨相关基因(Runx2、OSX、IGF-1、BMP-2)及成骨特异性标记基因(COL2A1、OC、ALP)的表达状况；4、1型糖尿病大鼠成脂基因PPARy的表达情况；5、Nfic基因表达变化对成骨相关基因及成脂基因PPARγ表达的影响；6、胰岛素对1型糖尿病大鼠Nfic及成骨成脂基因表达的干预作用。第一部分：1型糖尿病大鼠模型的制备、建模失败后补救措施及胰岛素对大鼠模型的治疗效果目的研究通过链脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)诱导建立1型糖尿病大鼠模型的方法及首次建模失败后的补救措施及效果,并对胰岛素对大鼠模型的干预作用进行初步探究。方法：健康6-8周龄雄性Wistar大鼠30只,随机分为2组,建模组25只,对照组5只。给予建模组大鼠一次性大剂量腹腔注射STZ(65mg/kg),同时对照组大鼠腹腔注射相同体积的柠檬酸缓冲液。72h后检测大鼠的血糖值判断建模是否成功。首次建模成功的大鼠随机分为两组,模型组和治疗组。治疗组于实验开始的第四天按(4-6U/kg/d)给予中效胰岛素皮下注射。对首次建模失败的大鼠常规饲养一周,再次腹腔注射STZ(65mg/kg),并命名为补救组,观察其成模状况。分别在建模后第0、2、4、6、8周测量大鼠的体重与血糖并观察其一般情况。于建模后第8周处死全部大鼠,取胰腺标本进行HE染色和胰岛素的免疫组化染色,观察胰腺组织的病理学改变。结果：1、体重状况：模型组与补救组大鼠体重降低或保持不变,对照组及治疗组大鼠体重增加明显。2、血糖状况：建模组有21只大鼠首次注射STZ 72h后,血糖值达到成模标准(随机血糖值≥16.7mmol/L),4只血糖值未达到成模标准,再次注射STZ72h后血糖值检测均达到成模标准。在建模成功组中随机选取20只均分为模型组和治疗组。持续观察8周,模型组大鼠均成模稳定,糖尿病症状明显,未见血糖转复正常。治疗组大鼠胰岛素治疗后,血糖由高血糖状态降为正常水平。对照组大鼠各项指标均未见异常。3、胰腺组织细胞学观察可见：对照组大鼠胰岛形态规则,细胞数目正常。与对照组相比,模型组、治疗组及补救组大鼠胰岛形态不规则,体积萎缩变小,胰岛内分泌细胞数量明显减少。补救组与模型组相比,其胰岛形态更不规则。与模型组相比,治疗组胰岛体积稍大,内分泌细胞排列更加整齐。4免疫组化观察：胰岛素胰腺免疫组化检测发现,与对照组相比,模型组和补救组胰岛素分布面积显著减少。补救组与模型组相比,其胰岛素分布面积略有增加。治疗组胰岛素分布面积略大于模型组。结论：一次性大剂量腹腔注射STZ可制备有效、稳定的1型糖尿病大鼠模型。首次建模失败后,适时再次注射STZ仍可制备高质量的1型糖尿病大鼠模型。胰岛素治疗可使1型糖尿病大鼠保持正常的血糖水平,在一定程度上对胰腺细胞产生治疗作用。第二部分：糖尿病大鼠Nfic与其它成骨相关基因表达的探究及胰岛素的干预作用目的探究糖尿病大鼠Nfic及成骨相关基因的表达变化及关系,研究胰岛素对糖尿病大鼠骨代谢的干预作用。方法 1型糖尿病大鼠模型制作同前,将大鼠分为3组,对照(正常)组(5只)、糖尿病模型组(10只)、胰岛素治疗组(10只)。治疗组于建模成功后第四天按(4-6U/kg/d)给予中效胰岛素皮下注射。观察三组大鼠体重、血糖变化；8周后处死全部大鼠,胰腺组织进行HE染色及胰岛素的免疫组化检测；Q-PCR法检测双侧股骨Runx2、Osterix (OSX)、Nfic、 COL2A1、OC(骨钙素)、ALP、BMP-2、IGF-1(胰岛素样生长因子-1)的mRNA表达水平。结果Q-PCR检测发现,OC、IGF-1、Runx2、OSX基因mRNA表达中,模型组明显低于对照组与治疗组,治疗组与对照组无显著差异。COL2A1基因的mRNA表达中,模型组明显低于对照组与治疗组(p<0.001,p<0.01),治疗组的表达量显著低于对照组(p<0.05)。ALP基因的mRNA表达中,模型组及治疗组均显著高于对照组(p<0.01),模型组较治疗组偏低,但无显著性差异(p>0.05)。BMP-2、Nfic基因的nRNA表达中,模型组与治疗组显著低于对照组(p<0.05,p<0.05)。模型组与治疗组之间无显著性差异(p>0.05)。结论在1型糖尿病大鼠模型中,骨组织Runx2、Nfic、OSX、BMP-2、IGF-1、OC、 COL2A1 mRNA表达水平显著下降,ALP mRNA表达水平显著升高,胰岛素的应用可逆转Runx2、OSX、IGF-1、OC、COL2A1 mRNA表达的下降,促进骨形成。第三部分糖尿病大鼠Nfic与成脂基因PPARy的表达的变化及胰岛素的干预作用目的研究糖尿病大鼠中Nfic、PPARy基因mRNA的表达变化及胰岛素对Nfic、 PPARy基因mRNA表达的干预作用。方法1型糖尿病大鼠模型制作同前,将大鼠分为3组,对照(正常)组(5只)、糖尿病模型组(10只)、胰岛素治疗组(10只)。治疗组于建模成功后第四天按(4-6U/kg/d)给予中效胰岛素皮下注射。模型建成后8周处死全部大鼠,Q-PCR法检测双侧股骨Nfic、PPARγ的nRNA表达水平。结果Q-PCR检测发现,在Nfic基因的mRNA表达中,与对照组相比,模型组和治疗组均显著减少(p<0.1)(p<0.001);治疗组与模型组相比,无显著性差异。在PPARγ基因mRNA的表达中,与对照组相比,模型组和治疗组均显著增加(p<0.001)(p<0.5);治疗组与模型组相比,显著减少(p<0.001)。结论:1型糖尿病大鼠Nfic基因mRNA表达水平下降可提高PPARγ基因mRNA的表达水平,从而促进脂肪的形成。胰岛素的干预不能完全扭转成骨转录因子Nfic的减少及成脂基因PPARγ的增加。