论文部分内容阅读
吸虫体被蛋白质与宿主的效应细胞和抗体等直接接触,被认为是疫苗候选分子和药物新靶点抗原分子。本论文对在肝片吸虫体被蛋白质中鉴定到一种CD59样蛋白(蛋白命名为FhCD59-1样蛋白)进行研究,序列分析表明在肝片吸虫中存在11种不同种类的CD59样蛋白。对这两种重要的CD59样蛋白质CD59-1和CD59-5的转录组序列进行克隆分析、体外真核重组表达并应用实时定量PCR方法检测这种蛋白质在成虫和新脱囊幼虫中的表达水平。此外,论文对其他6种吸虫的CD59样蛋白质进行数据库查找和分析。经过对FhCD59-1样蛋白编码区序列的DNA扩增、克隆、测序和序列分析获得该蛋白366bp的编码区,编码122aa,含有10个半胱氨酸和一个LY6/CD59蛋白家族的保守基序(motif) "CCXXXXCN"分析发现FhCD59-1样蛋白存在很高的多态性,两条不同肝片吸虫的34个FhCD59-1克隆序列检测到22个突变位点,可分为21种不同的氨基酸序列。FhCD59-1样蛋白基因组DNA的扩增、克隆、测序结果表明有两种不同的基因组DNA编码FhCD59-1样蛋白,其中一种DNA长度为554bp,未含有内含子。另一种DNA长为3437bp,包括3个外显子和2个内含子。对FhCD59-1样蛋白转录组cDNA和基因组DNA的各突变位点比对分析后发现RNA编辑的作用不明显,未能证实FhCD59-1样蛋白多态性产生与RNA编辑机制有关。应用一个格式搜索(pattern searching)在3个肝片形吸虫RNA-seq数据库中对FhCD59样蛋白进行查找和分析,获得11种不同类型的CD59样蛋白。系统进化分析表明FhCD59-1和FhCD59-5蛋白与曼氏血吸虫两种体被蛋白质CD59a和CD59b在同一个分支；通过不同吸虫数据库CD59样蛋白的查找和分析,获得了5种大片吸虫、6种大拟片吸虫、8种曼氏血吸虫、9种日本血吸虫、8种华支睾吸虫和3种麝猫后睾吸虫的CD59样蛋白质序列。将这7种吸虫的50条CD59样蛋白序列用MAFFT软件对比分析后应用MrBayes构建进化树,表明这些序列可分成7个不同的分化群。以pPICZαA为表达载体,选用毕氏酵母体外重组表达FhCD59-1和FhCD59-5样蛋白。得到表达的蛋白能够与抗6xHis标签的血清进行反应,但大于预期的蛋白,而且这些蛋白质无法用镍柱(Ni-NTA)层析纯化；质谱分析中发现表达FhCD59-1样蛋白质很难进行还原和胰蛋白酶消化,无法测定其多肽序列；应用实时定量PCR检测FhCD59-1和FhCD59-5样蛋白在肝片吸虫新脱囊童虫(FhNEJ)和成虫中的表达水平,结果表明FhCD59-1样蛋白在FhNEJ中的分泌量低于成虫,表达量比例为0.0058：1；FhCD59-5样蛋白在FhNEJ中的表达量高于成虫,表达量比例为15.42：1。本研究揭示了肝片吸虫中至少有11种不同的CD59样蛋白,其中FhCD59-1样蛋白具有很高的多态性,对FhCD59-1和FhCD59-5两种重要CD59样蛋白的体外重组表达和这两种蛋白质在新脱囊幼虫和成虫中的分布进行研究。并通过数据库分析确定大片吸虫、大拟片吸虫、曼氏血吸虫、日本血吸虫、华支睾吸虫、和麝猫后睾吸虫也具有不同的CD59样蛋白,这些CD59样蛋白质可以分为7个不同的分化群,提示它们可能具有不同的功能。本研究首先对肝片吸虫的CD59样蛋白进行研究和分析,为将来对这些蛋白质的功能研究和应用奠定基础。