研究背景妇科肿瘤包括子宫,卵巢,宫颈,输卵管,阴道和外阴肿瘤。据报道,每年新发现约80,720例妇科肿瘤并且每年大约有28,120病例死亡。细胞信号通路被一致认为是科研和药物研发当中最重要,最新的领域之一。在固体肿瘤中发现的最重要的通路之一是PI3K/AKT/mTOR通路。一些靶向PI3K/AKT/mTOR通路的药物正在妇科肿瘤病例中被评估其治疗作用。这个通路被认为是细胞蛋白合成,凋亡和葡萄糖代谢的重要的调节者。与分化组织相比,肿瘤倾向于采用一种独特的代谢过程,称为有氧糖酵解。即在有足够氧气的情况下代谢葡萄糖产生乳酸,而不是二氧化碳和水。肿瘤细胞的代谢异常被认为是癌症的标志之一。基于高通量的糖酵解,肿瘤细胞对葡萄糖的依赖不仅是由于能量的需要,而且是为了生物合成。因此,当葡萄糖缺乏时,或消耗葡萄糖的能力受到干扰时,肿瘤细胞比可以通过氨基酸或脂质代谢产生能量的正常细胞更容易死亡。葡萄糖缺乏,即去除培养基中的葡萄糖,可以促进GLUT表达,下调糖酵解,并诱导细胞凋亡。当实体肿瘤长大或使用抗血管生成药物时,葡萄糖缺乏也会发生。葡萄糖缺乏会触发一系列的反应,包括氧化应激、细胞毒性和炎症等,还可通过坏死或通过线粒体介导的或caspase-8依赖的细胞凋亡,介导细胞死亡。但肿瘤细胞通过激活生存信号转导通路网络来逃避死亡,这一通路网络包括磷酸腺苷活化蛋白激酶通路,丝氨酸／苏氨酸激酶(AKT)/mTOR通路,Raf/MEK(有丝分裂原活化蛋白激酶/ERK激酶)/ERK(细胞外信号调节激酶)通路,酪氨酸激酶信号通路。AKT已经被证明在肿瘤细胞中与葡萄糖转运和有氧糖酵解上调有关。激活的AKT使肿瘤细胞对葡萄糖存在依赖性。AKT磷酸化和抑制结节性硬化症蛋白1/2(TSC1/TSC2),从而激活促进蛋白质的翻译和细胞生长的mTORC1通路。另外,在慢性糖缺乏时,AKT磷酸化增加并且AKT通路高度激活。AKT激活的生存途径可以防止肿瘤细胞凋亡。AKT在调节细胞生长,增殖,存活,迁移和代谢方面起重要作用。肿瘤细胞通过抑制细胞死亡来促进细胞生存和永生化。充分的证据表明,异常的细胞凋亡可能会导致癌症等疾病的发生。AKT通路已被证实为细胞生存的主要调节因素,激活的AKT上调促生存因素并且抑制细胞凋亡来促进细胞存活。根据细胞代谢通路和存活通路聚合在AKT的事实提出了一种假说：AKT可以作为一个节点来连接这两个重要的过程。PI3K-AKT信号通路与很多恶性肿瘤密切相关,而异常激活或负调控的缺乏能导致肿瘤发生和进展,如PIK3CA基因突变、PTEN的丢失或突变、以及mTOR复合体的功能异常等。基于广泛的药理研究,在这条途径上的很多蛋白质,包括PI3K, AKT, mTOR,和PDK-1可能是用于治疗癌症的非常有价值的目标。针对这一途径的靶向性小分子抑制剂的研究正在进行,有的已进入临床试验阶段。虽然抗代谢药物提高肿瘤细胞对凋亡的反应,但是随后启动的生存途径增强了相反的作用,以保护细胞避免死亡。在2-DG,一种有效的和精确的糖酵解抑制剂,引起的能量应激状态下,抑制AKT已被证明可以增强细胞对凋亡的敏感。临床Ⅰ/Ⅱ期的研究显示,AKT的活化与AML患者对伊马替尼抵抗密切相关。PI3K-AKT通路在伊马替尼耐药的胃肠道肿瘤中也起着至关重要的作用。作为新发现的肿瘤标志,异常的代谢日渐成为肿瘤治疗的主要目标之一。因此,我们研究了长期葡萄糖剥夺情况下促进细胞存活的AKT的激活状态,探讨了在代谢应激的同时,使用AKT抑制剂或者GRP78抑制可以起到协同杀死对单独使用其中一种处理不敏感的肿瘤细胞。针对PDK1和GRP78的小分子抑制剂正处于临床实验阶段,这可以为其从实验研究到临床应用的转化提供方便。我们的研究揭示了由AKT介导的在长期葡萄糖应激时的一个关键的细胞存活机制。它对发展和实施针对细胞代谢和AKT信号通路的药物起到重要的作用。第一部分长期葡萄糖剥夺诱导选择性的AKT磷酸化位点的激活目的：检测不同细胞株在长期葡萄糖剥夺情况下AKT磷酸化位点的激活状态以及其底物的磷酸化状态。分析腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate-activated protein kinase; AMPK)和受体酪氨酸激酶(phosphoinositide3-kinase; RTK)/磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphoinositide3-kinase; PI3K)/AKT信号传导通路的关键节点,探讨导致AKT异常激活的机制。方法：本研究采用蛋白印迹检测宫颈癌,卵巢癌,乳腺癌等细胞株在长期葡萄糖剥夺情况下AKT不同位点以及其底物的磷酸化水平。并且采用蛋白印迹对腺苷酸活化蛋白激酶和AKT信号通路关键节点激酶激活状态进行研究。结果：1.在检测的细胞株中都可以观察到在长期葡萄糖剥夺情况下选择性AKTT308位点磷酸化的增加,而AKT Ser473位点则显示出与T308位点不同的时程变化。这与经典的生长因子刺激下AKT两个位点表现出的一致变化所不同。2.AKT的PH结构域,而不是激酶结构域,是选择性AKT T308位点磷酸化的增加所必需的。3.三磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1(3-phosphoinositide-dependent protein kinase-1; PDK1)和PI3K,而不是表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor; EGFR)和胰岛素样生长因子受体(insulin-like growth factor receptor; IGFR),对特异性激活AKT T308位点有重要的作用。4. AKT与三磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1,78kDa葡萄糖调节蛋白(78kDa glucose regulated protein; GRP78)形成的复合物很可能是导致长期葡萄糖剥夺情况下选择性AKTT308位点磷酸化的增加的原因。结论：本研究证实了短期和长期的葡萄糖剥夺通过不同的机制诱导AKT的激活和磷酸化。短期的葡萄糖剥夺通过p70S6K介导的反馈通路诱导了AKT Thr308和Ser473磷酸化的中度增加。而长期的葡萄糖剥夺则诱导了选择性的AKT Thr308位点磷酸化的显著增加,主要是通过AKT与GRP78和PDK1形成一个复合物来实现。长期葡萄糖剥夺诱导的AKT Thr308激活依赖于PDK1和PI3K。而EGFR虽然可以被长期葡萄糖剥夺所激活,但是对AKT的选择性增加并不是必须的。IGF1R不能被长期的葡萄糖剥夺所激活,其活性对AKT的选择性增加也不是必须的。长期的葡萄糖剥夺可以增加GRP78的表达,并且促进它和AKT的结合。这可能有利于AKT与PDK1结合,从而导致了在长期葡萄糖应激时选择性AKTThr308磷酸化的增加。AKT完整的PH结构域对长期葡萄糖剥夺诱导的选择性AKT Thr308磷酸化增加是必须的。第二部分特异性激活的AKT介导代谢应激的肿瘤细胞的存活目的：检测长期葡萄糖缺乏情况下,细胞能量代谢ATP的变化,研究特异性磷酸化AKT所激活的肿瘤细胞的存活机制,分析联合使用葡萄糖剥夺和AKT抑制剂或者GRP78抑制剂对细胞活力的影响。方法：本研究采用比色分析法检测长期葡萄糖剥夺情况下,肿瘤细胞内ATP水平；利用基因敲除细胞来检测长期葡萄糖剥夺情况下细胞自体吞噬对AKT激活的作用；反式蛋白分析法来研究葡萄糖应激时细胞信号通路的变化；集落形成实验来分析联合使用葡萄糖剥夺和抑制剂对细胞活力的影响；采用蛋白印迹分析葡萄糖剥夺时细胞的凋亡结果：1.长期葡萄糖剥夺导致细胞内ATP水平明显下降。加入丙酮酸类似物甲基丙酮酸后可以恢复细胞内ATP的水平,并且抑制了长期葡萄糖剥夺诱导的特异性增加的AKT T308位点的磷酸化。2.细胞的自噬作用对特异性AKT T308位点磷酸化的增加没有影响。3.选择性增加的AKT激活了一组特异性底物。长期葡萄糖剥夺可以诱导多种促进细胞存活的信号上调,抑制与存活相关性较低的信号通路。4.细胞凋亡随着葡萄糖剥夺的时间延长而增加,但是当葡萄糖剥夺延长到一定时间后反而下降。5.联合使用葡萄糖剥夺和GRP78勺抑制剂可以明显抑制肿瘤细胞形成集落的能力。结论：选择性增加的磷酸化的AKT激活了一组特异性,促进细胞存活的底物。而且GRP78是在长期葡萄糖缺乏时AKT的磷酸化和细胞存活所必须的。在代谢应激的同时,使用AKT抑制剂或者GRP78抑制可以起到协同杀死对单独使用其中一种处理不敏感的肿瘤细胞。AKT通路和AMPK通路的组成部分在长期葡萄糖应激时都被高度激活。这表明在面临严重的代谢应激时,细胞里的信号通路网络会重新适应和平衡来有效激活细胞的存活机制。