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在动物机体组成中,肌肉占动物体重的40%以上,是动物主要的运动和代谢器官。常见的肌肉生长发育异常包括:遗传缺陷引发的肌肉营养不良,年龄增长出现的肌肉减少症,缺乏锻炼引起的肌肉萎缩症,以及癌症导致的肌肉恶病质等。所有这些病症都严重影响人类的生活质量和动物的产肉性能。脂肪组织是机体能量的储存场所,脂肪组织大多以白色脂肪(white adipose tissue,WAT)和棕色脂肪(brown adipose tissue,BAT)的形式存在,近期在小鼠中发现还存在米色脂肪。体内过多的白色脂肪沉积会引发肥胖以及糖尿病,心脏病等疾病的发生,降低动物的生产性能。与白色脂肪不同的是,米色脂肪与棕色脂肪氧化代谢水平高,以产热的形式消耗大量能量,因而提高棕色脂肪和米色脂肪的沉积,降低白色脂肪的沉积成为解决肥胖相关疾病的关键。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mamlian target of rapamycin,m TOR)属于丝氨酸/苏氨酸激酶,参与蛋白表达,细胞增殖,细胞分化,能量代谢等多种生物过程的调控。通过敲除m TOR的结合蛋白Raptor或Rictor发现,小鼠会出现代谢紊乱,肌肉萎缩等症状;敲除Raptor的小鼠脂肪组织重量减小,脂肪代谢能力升高;而敲除Rictor的小鼠体重升高,但是脂肪组织的重量不变。以上结果接暗示m TOR对肌肉和脂肪生长发育和能量代谢有调控作用,然而在小鼠全身性敲除m TOR会导致小鼠胚胎期致死,限制了对m TOR的功能研究。随着转基因动物技术的发展和成熟,现在能够利用基因敲除技术,实现组织特异性和时间特异性敲除目的基因。在本研究中,采用Cre-Lox P系统建立了组织特异性m TOR敲除小鼠模型,研究m TOR在肌肉和脂肪组织生长发育中的功能,主要试验结果总结如下:1.敲除m TOR对肌肉干细胞行为和骨骼肌再生的影响通过Pax7-Cre ER小鼠介导,成功构建了骨骼肌卫星细胞特异性m TOR敲除小鼠模型。利用毒素诱导肌肉的损伤来模拟肌肉发育的过程,发现无论是敲除m TOR还是用雷帕霉素阻断m TOR信号通路,都会严重阻碍骨骼肌的再生过程,小鼠肌肉再生面积下降到对照组的50%左右(P<0.05)。为了检测敲除m TOR是否通过调控卫星细胞抑制骨骼肌再生,体外分离培养了单根肌纤维,结果显示,敲除m TOR不仅降低了单根肌纤维上细胞团的数目,而且降低了单个细胞团中卫星细胞的数目;与此相一致的是,在体外培养的卫星细胞中,观察到敲除m TOR之后,Ki67(细胞增殖标志物)阳性细胞比例显著少于对照组(P<0.01),细胞增殖相关基因TK和DHFR的表达量均显著低于对照组(P<0.01)。通过对卫星细胞的分化能力检测,发现Myo G阳性细胞要少于对照组,因此m TOR敲除后细胞早期分化程度降低;在分化5天的m TOR敲除细胞中观察到仅有少量的肌球重链蛋白表达,并且形成的肌管很瘦小,对照组则有大量粗壮的肌管形成,肌球重链蛋白表达水平高,因而对照组细胞分化程度更高。以上结果表明,m TOR敲除不仅抑制骨骼肌卫星细胞的早期分化,而且抑制了终末分化。对卫星细胞的定向的检测结果显示,处于静息状态、增殖状态和分化状态的细胞所占比例在m TOR敲除细胞和对照组细胞中差异不显著,表明m TOR的缺失不影响卫星细胞的定向。敲除m TOR或者利用雷帕霉素阻断m TOR信号通路之后,卫星细胞Pax7,以及成肌调控因子Myf5,Myo D和Myo G的表达下调。因此m TOR可能是通过调节Pax7和成肌调控因子的表达来实现对骨骼及卫星细胞行为的调控,进而影响骨骼肌的再生。2.敲除m TOR对心脏正常功能和心肌细胞的影响利用Mck-Cre小鼠介导m TOR的敲除,发现敲除小鼠在出生后1个月内死亡,死亡原因是心脏疾病。分别在动物个体的心肌组织和细胞水平研究了m TOR缺失引发的小鼠心脏变化。m TOR敲除之后,m TORC1和m TORC2信号通路同时受阻,导致蛋白质的翻译水平下调,特别是抗肌萎缩蛋白(dystrophin)的下调,引发了心肌细胞受损和心肌细胞的凋亡,并且小鼠出现心脏呈现纤维化的症状和扩张性心肌病。心脏肌纤维类型也发生了转变,敲除小鼠的Myh6+心肌纤维被能量代谢水平更低的Myh7+心肌纤维所取代。与此相一致的是,m TOR敲除之后心肌组织的脂肪酸氧化代谢和糖酵解水平都显著下调,推测能量水平可能无法满足心脏的正常活动需要,引发心力衰竭。综合以上结果,本研究为扩张性心肌病的提供了动物模型,揭示了m TOR在心肌细胞存活以及心脏组织的正常结构和功能维持方面发挥着重要的作用。3.敲除m TOR对脂肪组织生长发育的影响采用Adiponectin-Cre小鼠介导,成功构建了脂肪组织特异性m TOR敲除小鼠模型。经过称量发现m TOR敲除降低小鼠的脂肪沉积,BAT、前端皮下白色脂肪(anterior subcutaneous white adipose tissue,as WAT)、腹股沟白色脂肪(inguinal white adipose tissue,ing WAT)和腹内白色脂肪(visceral white adipose tissue,v WAT)的平均重量都低于对照组的50%以上(P<0.05)。H&E染色结果显示,m TOR敲除小鼠中BAT和WAT的脂肪细胞小于对照组,并且ing WAT部分区域出现了类似棕色脂肪组织的多腔室的细胞形态。m TOR敲除小鼠中,BAT的标志性基因UCP1和Prdm16的表达量升高到对照组的2倍左右,显著高于对照组(P<0.05),与脂肪组织形成相关的Pparγ升高到对照组的3倍,而C/EBPα的表达显著降低(P<0.05);脂肪特异性的基因Adiponectin,Leptin,Pparγ和Srebp1c在m TOR敲除小鼠的白色脂肪中表达量都显著低于对照组,能量代谢相关基因,Ucp1,Pgc1α和Pparα的表达都显著升高,因此,在脂肪组织中m TOR敲除可能抑制了脂肪细胞的分化,提高了能量代谢水平。然而,米色脂肪相关的标志基因,Tbx1、CD137和Tmem26的表达没有发生显著的变化,因此可能没有米色脂肪的形成。在体外分离培养的BAT和WAT成脂细胞分化过程中发现,脂肪形成相关基因表达下调,m TOR敲除会抑制成脂细胞分化。在寒冷环境下,小鼠的体温主要是依赖于棕色脂肪组织的能量代谢来维持,虽然m TOR敲除小鼠的棕色脂肪组织变小,但是在低温环境中体温与对照组差异不显著,这可能是由于单位重量的脂肪代谢能力升高所致。通过代谢笼试验,观察到m TOR敲除小鼠和对照组小鼠的产热能力差异不显著,因此也支持单位重量的脂肪代谢能力升高的推测。高能量饲料诱导小鼠的肥胖的试验结果发现,高能饲料喂养小鼠12周之后,对照组小鼠的棕色脂肪重量约为m TOR敲除小鼠的3倍;差异最大的白色脂肪是腹内脂肪,对照组小鼠腹内白色脂肪比m TOR敲除小鼠高达6倍,对照组小鼠as WAT和ing WAT重量达到m TOR敲除小鼠的2倍。以上结果表明,m TOR在脂肪组中的敲除抑制成脂细胞的分化和脂肪的沉积,m TOR敲除之后脂肪组织代谢能力升高,可以抵抗高能饲料诱导的肥胖。