微生物作为地球上最丰富的生物资源库之一,是新天然产物的重要来源,其次级代谢产物具有组成复杂、化学结构多样及活性成分含量低的特点。传统的分离方法主要依赖于开放型柱色谱和制备液相色谱的离线分离。然而,多步和长时间的分离过程,以及暴露于空气中,可能导致代谢物的结构转变。二维液相色谱将两支独立的色谱柱串联起来进行分离,具有样品损失小、无污染、重现性好、自动化及高通量分析的优点。本论文构建了新型二维液相色谱体系并将其应用于微生物次级代谢产物的分离,主要研究内容如下:1.基于分析型、制备型RPLC×RPLC二维液相色谱的微生物代谢产物分离新策略:运用分析型RP×RP二维液相色谱分析Chaetomium globosum SNSHI-5的乙酸乙酯萃取物的组成,为制备型分离优化色谱条件,从而运用MPLC×PHPLC在线制备型分离次级代谢产物,分离得到12个毛壳菌素类单体,包括2个新化合物。2.新型NPXRP色谱系统的构建:基于蒸发辅助吸附接口(TEAA),简化仪器接口设计,将不同分离机制的NPLC与RPLC联用,以典型的大肠杆菌发酵液的乙酸乙酯萃取物为研究对象,分析代谢产物的组成,并放大到制备,得到化合物28个。3.将新型在线二维NPLC×RPLC分离系统运用于目标菌株次级代谢产物的分离,包括不同环境来源的一株细菌和五株真菌发酵物的乙酸乙酯提取物。从分析放大到制备,共得到114个化合物,包括22个新化合物。4.最后对目标菌株所得化合物进行生物活性测试,包括细胞毒活性、抗炎活性、抗流感病毒活性、抗茶叶致病真菌活性。从中发现了4个细胞毒活性化合物,7个抗炎活性化合物,11个化合物具有抗流感病毒活性,4个化合物抗茶叶轮斑病活性强于阳性药硫菌灵。