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目的：
基于古典方剂黄芪汤有效抗肝纤维化的前期研究结果，明确该方抗肝纤维化有效组分配伍的物质基础并阐释有效组分配伍的主要作用机制。
方法：
1.筛选实验部分：4周内给大鼠腹腔注射二甲基亚硝胺(dimethylnitrosamine，DMN)12次制备肝纤维化模型，于造模第3周首日开始给药干预至4周末。采用均匀设计对“黄芪汤”中的黄芪总皂苷(astragalosides，AS)、黄芪总黄酮（astragalus flavonoids，AF）、甘草酸(glycyrrhiza acid，GA)及甘草总黄酮(glycyrrhiza flavonoids，GF)等4种组分或成分以4因素8水平安排给药；以肝组织羟脯氨酸(hydroxyproline，Hyp)含量和丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase，ALT)活性为观测指标，采用基于多元回归模型(multiple regression model，MRM)和非线性混合效应模型(nonlinear mixed effect model，NONMEM)的计算机模拟，分析其抗肝纤维化效应的最优组方。
2.组分配伍复方的再验证：采用DMN和胆总管结扎(bile duct ligation，BDL)制备的两种大鼠肝纤维化模型，进行有效组分配伍复方的验证实验。①4周内给大鼠ip DMN12次制备肝纤维化模型。观察造模3d，14d，28d模型组的动态变化，于造模第3周首日分为模型对照组以及黄芪汤组、AS组、GA组及AS/GA联用组等5个给药组，于继续造模的同时给药至4周末，处死大鼠获取检测标本。大鼠肝组织HE染色及胶原染色、肝组织Hyp含量，血清肝功能：ALT、天冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase，AST)及碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)活性、白蛋白（albumin，Alb）及总胆红素(total bilirubin，TBil)含量；免疫组化及蛋白免疫印迹方法观察肝组织α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)表达水平。②BDL制备继发性胆汁淤积性肝纤维化模型，观察模型组、黄芪汤、熊去氧胆酸(ursodeoxycholic acid，UDCA)、AS/GA联用或单用组大鼠肝组织HE染色及胶原染色、肝组织Hyp含量，血清肝功能：ALT、AST及ALP活性、Alb及TBil含量；免疫组化及蛋白免疫印迹方法观察肝组织α-SMA表达水平。
3.有效组分配伍作用机制研究：对上述DMN大鼠肝纤维化模型，在药效学比较基础上，采用实时荧光定量聚合酶链式反应(real time polymerase chain reaction，Real time PCR)方法检测α-SMA、转化生长因子（transforming growth factor，TGF）β1、骨形态发生蛋白7(bone morphogenetic protein7，BMP7)、Smad7、干扰素-γ(interferon-γ，INF-γ) mRNA表达水平；蛋白免疫印迹方法观察肝脏组织TGFβ1、Smad7、BMP7、Smad5、P-Smadl/5/8、信号转导子与转录激活子（signal transducerand activator of transcriptionl，STAT1）、P-STATl、Arkadia蛋白表达水平。
结果：
1.通过均匀设计研究，明确组分的最优配伍复方(黄芪总皂苷、甘草酸的配伍比例为164:48)，并得到有效验证。与模型组相比，组分复方及黄芪汤均可显著改善肝纤维化病理组织学变化，显著降低肝组织Hyp含量、血清ALT、AST以及ALP活性(P＜0.05)；有效组分复方可显著降低肝组织Hyp含量及血清ALT活性并以AS/GA联用效果最为显著。与同期模型组相比，黄芪汤、AS/GA联用或者单用均可显著减少α-SMA表达并以AS/GA联用效果最为显著。
2.与同期模型组相比，黄芪汤、AS/GA联用或者单用可显著抑制TGF-β1表达并以AS单用效果最为显著；黄芪汤、AS/GA联用或者单用可显著上调BMP-7及P-Smadl/5/8表达；黄芪汤、AS/GA联用或者GA单用可显著促进Smad7mRNA表达并以AS/GA联用效果最为显著；黄芪汤、AS/GA联用或者AS单用可显著减少Arkadia蛋白表达并以AS/GA联用效果最为明显；黄芪汤、AS/GA联用或者AS单用可显著升高Smad7蛋白表达并以AS/GA联用效果最为明显；黄芪汤、AS/GA联用或单用可显著升高IFN-γmRNA表达并以AS/GA联用效果最为明显；黄芪汤、AS/GA联用可显著升高P-STATl蛋白表达并以AS/GA联用效果最为明显。
结论：
1.均匀设计是从多种中药组分或成分中快速优化抗肝纤维化组分复方的一种重要方法。
2.黄芪总皂苷和甘草酸是黄芪汤发挥抗肝纤维化作用的有效组分，二者配伍在减少肝组织胶原沉积、改善肝功能以及抑制HSC活化等方面具有明显的协同增效作用。
3.黄芪总皂苷与甘草酸联用或者单用对于降低TGF-βl生成均显著优于黄芪汤原方，并以黄芪总皂苷单用效果最为明显。
4.提高Smad7蛋白对TGFβ1信号转导的负调控作用是黄芪总皂苷和甘草酸抗肝纤维化配伍协同效应的主要机制之一，可能通过IFN-γ/JAK/STATl、泛素-蛋白水解酶复合体通路等多种信号通路而协同促进Smad7的表达而抑制TGFβ1信号转导。
5.黄芪总皂苷与甘草酸单用或联用组能显著提高DMN肝纤维化大鼠肝组织BMP-7mRNA、蛋白及P-Smadl/5/8蛋白表达，这一作用途径不但可促进Smad7的表达而抑制TGFβ1信号转导，而且BMP7蛋白表达的增加对肝纤维化可具有保护肝细胞、促进肝细胞再生的综合效应。
黄芪总皂苷和甘草酸的配伍较其各单一组分更具显著的整体、综合药理优势，充分显示了中医方剂配伍理论的科学原理。