论文部分内容阅读
冷激蛋白（Cold shock protein,Csp）作为应激蛋白几乎分布于所有原核生物当中。当细胞遭受非生物逆境胁迫时,Csp作为RNA的分子伴侣,与单链核苷酸非特异性结合,阻止mRNA二级结构的生成,避免转录和翻译终止,保证细胞的正常代谢。除此之外,Csp还作为转录激活因子,与启动子结合提高基因的转录水平。大肠杆菌（Escherichia coli）和枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的Csp基因已经被克隆,并验证了其功能,转化植物后能显著改良转基因植物对干旱等非生物逆境的抗性。在极端非生物逆境下生存的极端微生物,大多具有独特细胞结构和环境适应机制。嗜盐芽孢杆菌（Halobacillus halophiles）就是其中一种,它能够产生诸如Csp等多种抗性溶质,抵御高盐环境的胁迫危害。本研究在生物信息学分析的基础上,根据玉米基因组密码子偏爱性,对嗜盐芽孢杆菌Csp基因（HhCsp）进行密码子优化,构建双子叶植物表达载体,农杆菌介导法转化拟南芥,探索其异源表达改良植物耐盐耐旱等非生物逆境抗性的可能,为下一步转化玉米等作物抗逆转基因研究奠定基因基础。主要结果如下:（1）嗜盐芽孢杆菌HhCsp基因的cDNA序列全长195 bp,编码65个氨基酸。同源建模分析表明,HhCsp蛋白由5条反向折叠的β链构成桶状结构,表面含有芳香族氨基酸。与已知功能的枯草芽孢杆菌CspB序列相似性达到83.58%,包含RNA结合基序RNP1（KGFGFI）和RNP2（VFVHF）等Csp蛋白典型的保守结构域。因此推测HhCsp基因的编码蛋白同样具有分子伴侣功能。（2）根据玉米基因组密码子偏爱性对HhCsp基因序列进行优化,使得G/C含量从39.71%提高到50.26%,碱基改变了10.25%,密码子改变了30.76%,与原始基因相似性为85.35%,自由能从70.6降低到40.39,消除了原有基因的稀有密码子,使优化后的基因密码子使用频率与玉米基因组基本保持一致,以利于其在玉米中高效转录翻译。（3）为了确保转基因植物的安全性,我们把优化后序列提交到NCBI数据库,进行了与已知毒蛋白序列同源性、过敏原比对以及抗营养因子比对等安全性筛查,表明HhCsp基因是安全的,可用于后续转化。（4）为了验证优化后的基因抗逆性功能,我们首先构建了双子叶植物表达载体pCAMBIA2300-35S-HhCsp,经过酶切和测序鉴定,表明载体构建正确。农杆菌介导法转化拟南芥（哥伦比亚生态型）,经过PCR阳性检测及RT-PCR验证,表明获得的5个独立转化事件中外源基因已成功表达。将转化事件自交繁育至T3代,获得纯合株系可用于后续抗性鉴定。（5）在添加高浓度的甘露醇和NaCl的1/2 MS高渗培养基上,转基因株系和野生型拟南芥根系发育及种子发芽率均随着甘露醇和NaCl浓度的增加而受到抑制,但转基因株系根系发育和发芽率明显好于野生型对照,说明在高盐高渗胁迫下,HhCsp转基因株系根系发育和种子发芽率显著优于未转化对照。（6）在营养土培养中,自然干旱20 d后,转基因株系和野生型拟南芥的生长均受抑制,但转基因株系只有部分萎蔫,而野生型基本全部枯萎。复水1周后,转基因株系部分恢复正常生长,而野生型则全部干枯死亡。而用350 mmol/LNaCl浇灌幼苗模拟高渗胁迫时,转基因株系仅部分萎蔫,野生型全部枯死。这些结果说明,我们优化的嗜盐芽孢杆菌HhCsp基因,能够显著改良受体植物拟南芥幼苗的耐盐耐旱性。（7）上述实验已经证明异源表达HhCsp可显著提高拟南芥的抗旱性及抗盐性,因此,我们又构建了单子叶植物表达载体pTF101.1-Ubi-HhCsp,农杆菌介导法转化玉米优良自交系18-599红的胚性愈伤组织,获得5个转化事件,正在进行自交繁育和分子鉴定,以期获得纯合株系并进行抗逆性验证实验。上述结果表明,HhCsp基因已经整合到拟南芥基因组中,异源表达明显提高了转基因株系的耐旱性和耐盐性。密码子优化后的HhCsp基因可用于玉米等作物的抗逆转基因研究。