副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）是一种嗜盐性革兰氏阴性弧菌，广泛存在于浅海海水、海底沉积物及鱼、虾、蛤、贝、蟹等海产品中。当人们食用生的或未经彻底煮熟的，且被携带关键毒力因子的副溶血弧菌污染的海产品时，就有可能感染，引起以发热、恶心、呕吐、腹痛、腹泻等为主要症状的急性胃肠炎，严重者可发展成败血症，如若治疗不及时可引起死亡。副溶血弧菌含有多种毒力因子，如直接耐热溶血素（Thermostable direct hemolysin, TDH）、耐热相关溶血素（TDH-related hemolysin, TRH）、III型分泌系统（Type III secretionsystem, T3SS）及荚膜多糖等，它们均与其致病性密切相关，其中TDH是神奈川现象的直接原因。目前，副溶血弧菌已是引起食物中毒的首要病原菌。密度感应（quorum sensing, QS）是细菌中普遍存在一种级联信号传导机制，细菌通过合成、分泌并感应信号分子（自诱导因子，autoinducer），最终通过激活或抑制其核心调控子的表达来控制细菌生物膜形成、毒力因子表达、耐药性等细胞途径，从而有利于细菌生存繁殖与致病。QS系统也普遍存在于弧菌中，其中以哈氏弧菌被研究的最为详细：当处于低密度生长（Low cell density, LCD）时，细胞外低浓度的自诱导因子信号能使LuxO磷酸化，磷酸化后的LuxO能激活小RNA Qrr1-5的转录，Qrr1-5在Hfq伴侣蛋白的参与下激活AphA而抑制LuxR的表达，AphA进而再调节下游毒力因子的表达和生物膜形成；当细菌处于高密度生长（High cell density, HCD）时，细胞外高浓度的自诱导因子信号能使磷酸化的LuxO去磷酸化，导致Qrr1-5不表达，使得Qrr1-5对AphA的激活及对LuxR的抑制作用被解除，此时LuxR大量表达后能调节下游基因的转录。可见，AphA和LuxR分别是哈氏弧菌QS系统LCD和HCD下的核心调控子，QS系统正是通过控制其核心调控子的转录表达水平而实现对生物膜形成和毒力基因的表达调控。哈氏弧菌QS系统的信号合成与传导机制所需的所有基因，在副溶血弧菌中均能找到同源的基因，如副溶血弧菌在LCD时的核心调控子是AphA，而在HCD时的核心调控子是OpaR，二者与哈氏弧菌的AphA和LuxR均具有90%以上的同源性。但是，目前对副溶血弧菌QS系统的级联信号传导机制，及AphA和OpaR功能的认识还很肤浅，亟需深入系统地研究。本文中，我们分别通过比较弧菌中OpaR和AphA及其直系同源蛋白已知和可能的结合序列，并利用在线工具Regulatory SequenceAnalysis Tools（RSAT，http://rsat.ulb.ac.be/rsat/）计算结合序列中每个位置上4种碱基出现的概率（Position frequency matrix，PFM），以构建OpaR和AphA的识别基序，结果显示OpaR和AphA的结合基序分别为TATTGATAAA-TTTATCAATA和ATATGCA-N6-TGCATAT，二者均为一个反向互补重复序列。分别利用上述基序预测副溶血弧菌QS系统级联信号传导过程中哪些关键基因是受OpaR和AphA直接调控的，结果显示：OpaR对自身基因、aphA和qrr2-4，AphA对自身基因、opaR和qrr4可能具有直接的调控作用。进而，我们利用凝胶阻滞实验（EMSA）、DNase I足迹实验、β-半乳糖苷酶报告基因融合实验（LacZ）、引物延伸及qRT-PCR等实验技术分别研究OpaR和AphA对上述靶基因的转录调控机制，结果表明：当用HI-0.5%S平板培养副溶血弧菌至高密度时，OpaR能直接抑制qrr2-4、aphA和opaR的转录表达，其结合位点均包含一段与基序相似的序列；当用M肉汤培养副溶血弧菌至低密度（OD600=0.15-0.2）时，AphA能直接抑制qrr4、aphA和opaR的转录，其结合位点也均包含一段与基序相似的序列；另外，AphA对qrr2-3的转录具有间接抑制作用。由于OpaR和AphA对上述基因的转录调控机制与哈氏弧菌中的完全一致，因此上述结果不仅表明我们所构建基序的可靠性与实用性，也说明了副溶血弧菌QS系统级联信号传导机制与哈氏弧菌的基本一致，这为后续实验打下了坚实的基础。副溶血弧菌在自然生存与感染致病的过程中，必然面临众多环境信号的刺激，比如温度、pH、渗透压等，在此过程中其毒力因子的表达必然是被复杂的转录调控网络紧密调控的，而解析这个调控网络有助于理解副溶血弧菌的致病机制。ToxR是副溶血弧菌的毒力调控因子，已有研究表明它能调控溶血素基因tdh、T3SS1相关基因及外膜蛋白基因ompU的表达，但是其调控的分子机制仍然未被阐明。VPA0606是AraC家族的转录调控子，目前只知道该蛋白能影响副溶血弧菌生物膜形成，但对其分子作用机制一无所知。另外，VPA0606可能还参与调控副溶血弧菌毒力因子的表达。在副溶血弧菌基因组中，vpa0607与vpa0606转录方向相同，且二者基因间区仅有71bp，RT-PCR结果表明二者共转录，vpa0607为首基因。引物延伸结果显示toxR和vpa0607表达也呈现出密度感应的特性，这提示OpaR和AphA可能对toxR和vpa0607的转录具有调控作用。因此，我们采用HI-0.5%S肉汤培养副溶血弧菌研究了OpaR和AphA对toxR和vpa0607的转录调控机制。我们首先采用引物延伸和Western blot研究了菌密度对opaR、vpa0606、aphA和toxR的转录调控，结果表明：opaR和vpa0606在OD600=0.6-0.8时表达水平高，aphA在OD600=0.05-0.2时转录水平高，toxR在OD600=0.2-0.4时转录水平高。进而，我们采用引物延伸、LacZ等实验技术研究了OpaR和AphA对自身基因及对toxR和vpa0607的转录调控机制，结果表明：在OD600=0.05-0.2时，AphA直接抑制aphA和opaR，而间接抑制toxR的转录，但是AphA对vpa0607-0606具有间接的激活作用；在OD600=0.6-0.8时，OpaR能直接抑制aphA、opaR和vpa0607-0606，而间接抑制toxR的转录。由于OD600=0.05-0.2时AphA激活vpa0607-0606的转录，这提示vpa0607-0606可能在低密度下转录水平高，引物延伸结果显示该操纵子的转录特性确实与aphA的一致。然而，vpa0606与vpa0607共转录，VPA0606又在OD600=0.6-0.8时蛋白表达水平高，这似乎相互矛盾。实际上，VPA0607蛋白是一种DNase II，能从mRNA的3′-端向5′-端水解磷酸二酯键，从而使RNA降解。我们推测：只有当细胞内VPA0607蛋白水平低时，处于基础表达的vpa0607-0606才能得以翻译成VPA0606蛋白。这种假设需要我们后续进行实验验证。总之，我们的实验结果不仅证明了副溶血弧菌QS系统和哈氏弧菌具有相似的级联信号传导机制，而且显示出ToxR和VPA0606也参与到QS系统的调控机制中来。AphA、OpaR、ToxR和VPA0606随菌密度的变化而表现出不同的表达丰度，分别在不同的生长时段发挥主要作用，最终紧密调控毒力因子的表达和生物膜的形成等细胞途径。本文的研究不仅为后续实验打下了坚实的理论基础，也有助于我们理解副溶血弧菌的致病机制。