【摘 要】
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刚地弓形虫（Toxoplasma gondii,T.gondii）是一种具有脑嗜性的人畜共患寄生性原虫,与神经变性疾病有着紧密的联系,危害很大,其作用机制尚不清楚。速殖子能够穿过血脑屏障并且可以在脑组织中形成包囊,从而建立慢性感染,进而可以对机体的行为,记忆力以及辨别力等产生影响。目前尚无根治弓形虫的药物,所以进行体外实验研究弓形虫对宿主可能的损伤机制,提供新的研究思路,从而对弓形虫病预防以及治疗
【基金项目】
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国家重点研发计划项目（2017YFD0501305）； 广东省自然科学基金项目（2016A030313396）； 广东省重大科研项目（特色创新）（2017KTSCX018）； 广州动物园专项项目（h2016141）；
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刚地弓形虫（Toxoplasma gondii,T.gondii）是一种具有脑嗜性的人畜共患寄生性原虫,与神经变性疾病有着紧密的联系,危害很大,其作用机制尚不清楚。速殖子能够穿过血脑屏障并且可以在脑组织中形成包囊,从而建立慢性感染,进而可以对机体的行为,记忆力以及辨别力等产生影响。目前尚无根治弓形虫的药物,所以进行体外实验研究弓形虫对宿主可能的损伤机制,提供新的研究思路,从而对弓形虫病预防以及治疗提供新的方向是很有意义的。在本课题组前期研究中,利用iTRAQ技术对感染鼠脑和正常鼠脑进行测序分析选取了差异表达最为显著的脑神经发育调节蛋白Drebrin作为诱饵蛋白,获取了与其相互作用的6种弓形虫蛋白,其中经过qPCR验证组蛋白H4差异表达明显。鉴于组蛋白H4对宿主细胞损伤的特点,剖析弓形虫组蛋白H4在弓形虫脑病损伤机制,需要进一步的探究。为探究弓形虫组蛋白H4生物功能,首先对弓形虫ME49株组蛋白H4基因序列进行分析,然后构建原核重组质粒pGEX-6p-1-H4,制备多克隆抗体。并构建真核重组质粒pcDNA3.1（+）-HA-H4,通过细胞转染,进行细胞计数以及WB检测细胞凋亡以及自噬相关蛋白Bcl-2以及LC3Ⅰ/Ⅱ表达量的变化。实验结果表明,成功构建了原核重组质粒pGEX-6p-1-H4以及真核重组质粒pcDNA3.1（+）-HA-H4。Western blot检测结果发现,成功制备具有特异性的弓形虫组蛋白H4多克隆抗体,且效价均>1:32K,并通过间接免疫荧光检测到组蛋白H4在弓形虫ME49株速殖子中的表达与分布情况。真核重组质粒pcDNA3.1（+）-HA-H4细胞转染,表明弓形虫组蛋白H4基因在N2a细胞中表达,导致细胞凋亡相关蛋白Bcl-2下调和细胞自噬相关蛋白LC3Ⅱ上调,但在RAPA组,Bcl-2却有上调趋势。结果表明,弓形虫组蛋白H4的表达可能促进N2a细胞的凋亡和自噬,而RAPA与组蛋白H4表达蛋白相互作用进而抑制细胞凋亡,从而保护神经系统,这为弓形虫病的预防治疗提供了新思路。
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