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大麦是一种集粮食、饲料、营养保健、酿造加工等用途于一身的“多元作物”,研究和应用前景十分广泛。在系统生物学的基础上,借助于代谢组学研究技术,可以从全新角度解析大麦复杂生物学性状的遗传基础,了解代谢产物与大麦表型性状的关系,挖掘控制重要生物学性状的关键基因,提高大麦重要性状的遗传改良效率。本实验以“华矮11×华大麦6号”DH群体为材料,利用高密度的遗传连锁图谱对该群体122个株系成熟种子的代谢产物进行mQTL分析,对DH群体双亲中重要代谢途径中的关键基因进行筛选,并将所获得的候选基因进行克隆和体外酶活验证,主要研究结果如下:1.成熟种子mQTL分析:通过广泛靶向代谢组学分析方法对大麦DH群体的成熟种子样品进行检测,共获得黄酮类、多酚类、氨基酸及其衍生物以及核酸及其衍生物为主的1150种代谢物,其中包括注释代谢物555种。利用高密度遗传连锁图谱对1150个代谢性状进行mQTL检测,其中799(69.48%)个代谢性状共定位到1116个mQTL,且这些代谢物所定位到mQTL的数量为1-6个不等,定位到1个mQTL的代谢物最多,占48.96%。所定位的1116个mQTL中表型变异率最大为多酚类代谢物wt00516,位于7H染色体538.20Mb-546.65Mb区间上,解释了高达92.0%的表型变异率。另外,1116个mQTL中共945个mQTL定位在2H和7H染色体上,并且针对黄酮类、多酚类、氨基酸及其衍生物以及核酸及其衍生物发现了14个mQTL热点。2.代谢产物候选基因的筛选及克隆:结合基因组、基因注释信息、相关代谢物的化学结构和其同源基因在水稻等模式作物中的研究结果,共筛选出13个与黄酮、多酚、氨基酸及其衍生物和核苷及其衍生物4类代谢物相关的候选基因,从中挑选7个具有单一外显子且目标条带明显的候选基因进行克隆和序列分析。结果发现3个脱羧酶基因(Hv TDC-1、Hv TDC-2、Hv TDC-3)在两亲本华矮11和华大麦6号中的序列全长均为1533bp,编码了一个含有510个氨基酸残基的蛋白;1个糖基转移酶的基因Hv UGT-1在两亲本中的序列全长均为1512bp,编码了含有503个氨基酸残基的蛋白,这4个基因的序列在两亲本之间没有序列差异;另外2个糖基转移酶的基因(Hv UGT-2、Hv UGT-3)和1个酰基转移酶的基因(Hv AT-1)在两亲本中存在不同程度的序列差异,其中Hv UGT-2在两个亲本中序列全长均为1524bp,编码了含有507个氨基酸残基的蛋白,存在19个碱基的差异,从而导致氨基酸序列中6个氨基酸残基差异;Hv AT-1在两个亲本中序列全长均为1377bp,编码458个氨基酸残基的蛋白,存在11个碱基的差异,相应造成6个氨基酸残基的差异;Hv UGT-3在两个亲本华大麦6号和华矮11中的序列全长分别为1140bp和1131bp,分别编码379个氨基酸和376个氨基酸。通过序列比对发现在华矮11的序列(Hv UGT-3a)与参考基因组的序列完全一致,但华大麦6号的序列(Hv UGT-3b)则与参考基因组间存在多个碱基的差异,并且在1090bp处插入了一个碱基G,使其后的序列发生了移码突变,导致其延迟终止,并且Hv UGT-3a与Hv UGT-3b编码的蛋白的前50个氨基酸残基中存在两个跨膜结构域,最终影响了其蛋白质的三级构象。3.代谢相关基因的功能验证:通过构建7个候选基因的原核表达载体,并确定了其适宜的蛋白表达条件。对诱导表达的蛋白进行体外酶活验证。发现6个候选基因(Hv UGT-1、Hv UGT-2、Hv TDC-1、Hv TDC-2、Hv AT-1、Hv TDC-3)具有相应的酶活功能。糖基转移酶基因Hv UGT-1、Hv UGT-2可以有效的将UDP中的葡萄糖苷转移到麦黄酮的羟基上,完成糖基化修饰。但Hv UGT-2基因在双亲中的活性存在差异,其在华矮11中的活性远大于华大麦6号。脱羧酶基因Hv TDC-1、Hv TDC-2、Hv TDC-3可以使色氨酸脱去羧基生成色胺,并且其在双亲中一致具有较高的活性。酰基转移酶基因Hv AT-1在两亲本中都能以丙酰Co A为辅酶,使芹菜素-7-O糖酰基化。由于成熟种子中的代谢物由灌浆期积累,所以我们利用q RT-PCR对6个有酶活功能的候选基因在华矮11和华大麦6号籽粒灌浆的7个不同时期进行表达量分析,结果发现基因Hv UGT-2、Hv TDC-1、Hv TDC-2、Hv TDC-3的表达量在双亲之间存在明显的差异,其中Hv TDC-1和Hv TDC-2基因只在华矮11灌浆第5期超量表达,而在华大麦6号灌浆的7个时期的表达量均极低,这与成熟种子中相关代谢物的含量差异相一致,说明成熟种子中的相关代谢性状差异是由基因表达量的差异引起。本研究通过代谢组学研究手段对大麦代谢途径中参与表达调控的关键基因进行克隆和功能验证,为进一步系统解析大麦代谢产物与表型性状的遗传基础提供参考。