自交不亲和性(self-incompatibility,SI)是植物为了限制自交衰败和促进杂交优势,在长期进化过程中形成的一种复杂而完善的重要遗传机制。芸薹属植物表现为孢子体自交不亲和性(Sporophytic self-incompatibility,SSI),当前国际前沿对于SSI的分子研究内容主要集中在SI信号转导元件协同作用以抑制自体花粉萌发或花粉管生长的机制上。早期普遍认为在自花花粉落到干性柱头上后,花粉S-位点半胱氨酸富集蛋白(S-locus cysteine-rich protein,SCR)与柱头S-位点受体激酶(S-locus receptor kinase,SRK)胞外结构域结合,从而导致SRK的构象发生改变,使其释放原本结合在SRK激酶结构域的类硫氧还蛋白1/2(Thioredoxin-h-like protein 1/2,THL1/2),激发SRK激酶活性,而后激活的SRK与M-位点受体激酶(M-locus protein kinase,MLPK)发生某种瞬间的相互作用,将SI信号传递到柱头乳突细胞的胞内。接着SRK与臂重复蛋白1(Arm repeat containing 1,ARC1)结合引发ARC1的磷酸化作用与细胞质定位,随后ARC1泛素化Exo70A1,进而致使柱头乳突细胞中水分和一些小分子物质不能正常分泌,最终实现SI反应。然而介导SRK与ARC1互作的核心结构域是怎么样的,ARC1在自交不亲和反应中如何介导亲和因子Exo70A1的泛素化降解还是未知的,甚至ARC1是否是SRK唯一下游底物还存在质疑。虽然近年来人们在甘蓝等芸薹属作物孢子体型自交不亲和信号传导机理研究方面取得了显著进展,但是关于SRK下游信号传导通路组成蛋白的分离与鉴定的研究要滞后得多。自从1998年ARC1被鉴定为SRK的下游靶蛋白后,直至2009年才发现Exo70A1作为自交亲和因子与ARC1发生泛素作用被降解。然而转基因试验发现反义抑制B.napus和A.lyrata中ARC1基因表达,以及过量表达B.napus中Exo70A1基因,均只能部分打破材料的不亲和性,由此说明ARC1-Exo70A1组成的信号通路可能只是SRK下游信号传导途径的其中一个分支。植物受体激酶下游信号传导途径通常都是由多个信号元件和信号分支组成的信号网络。对于自交不亲和信号传导过程,当前国际上普遍认为柱头内还存在其他未知信号元件和信号分支,它们可能与ARC1-Exo70A1分支一起共同参与下游信号传导,在芸薹属和拟南芥不同生态型中,不同的信号分支参与信号传导的效应不同,因此当前研究工作的重点就是分离和鉴定这些未知的信号元件和信号分支并探讨其功能。基于此,本研究以高度自交不亲和甘蓝“A4”为材料,扩增SRK激酶域、ARC1和Exo70A1全长序列,通过酵母双杂交技术筛选SRK-ARC1-Exo70A1的核心互作模体,基于转录组测序筛选与SRK下游响应自交不亲和反应的泛素靶蛋白,同时克隆得到SRK下游MLPK的新转录本MLPKn1,通过生物信息学分析、q RT-PCR、瞬时表达及转基因等技术研究其功能。获得主要研究结果如下:(1)SRK-ARC1-Exo70A1核心作用结构域的确定利用分子克隆技术从高度自交不亲和甘蓝材料中扩增得到SRK激酶域、ARC1和Exo70A1全长序列,通过生物信息学分析发现SRK激酶域包含DUF3660、Tyrkc和DUF3403结构域,ARC1包含亮氨酸拉链、卷曲螺旋、U-box及4个ARM结构域,Exo70A1包含亮氨酸拉链、高变区、反式SUMO化修饰模体及一个典型的Exo70结构域。构建21个包含所有不同结构域的截短体,将SRK及其截短体,Exo70A1及其截短体分别亚克隆到p GADT7载体中,ARC1及其截短体分别亚克隆到p GBKT7载体中,用PEG/Li Ac法将获得的重组质粒两两组合分别共转化到酵母AH109感受态中,观察融合菌株在SD/-Leu-Trp-His-Ade/X-a-gal/25 m M 3-AT平板上的菌落生长情况和颜色变化情况,进一步通过β-半乳糖苷酶活性检测相互作用强度。结果发现,在SRK-ARC1互作组合中,SRK激酶域和ARC1含C端臂重复区截短体组合的β-半乳糖苷酶活性最大,说明它们是构成二者互补界面的核心区段,缩短SRK激酶域中的任何结构域,或减少ARC1任意一个臂重复区,都会影响二者的相互作用。在ARC1-Exo70A1的互作组合中,ARC1含亮氨酸拉链和蜷曲螺旋的截短体与Exo70A1含高变区和反式SUMO化修饰模体的截短体组合的β-半乳糖苷酶活性最大,二者是构成ARC1-Exo70A1互作界面的的核心区段;此外,比较SRK-ARC1-Exo70A1之间的β-半乳糖苷酶活性发现SRK-ARC1的作用强度小于ARC1-Exo70A1的作用强度。(2)基于转录组测序筛选出3个新的与S-位点受体激酶互作的泛素蛋白对比未授粉和授粉30 min甘蓝柱头转录组数据,筛选出5个显著差异表达的Bo PUB蛋白基因:Bo PUB3、Bo PUB9、Bo PUB34、Bo PUB43和Bo PUB44。其中Bo PUB3和Bo PUB9在自花授粉处理30 min后显著下调表达,Bo PUB34,Bo PUB43和Bo PUB44在自花授粉处理30 min后显著上调表达。对5个Bo PUB蛋白基因的克隆和序列分析发现,5个Bo PUB蛋白均属于植物泛素家族成员,其中Bo PUB3、Bo PUB9、Bo PUB43、Bo PUB44与ARC1一样属于PUB-ARM家族,Bo PUB34属于Ser/Thr kinase家族。进化分析发现ARC1与Bo PUB9遗传关系最近,Bo PUB3次之,与Bo PUB34遗传关系最远。通过酵母双杂交和GST-pull down检测发现,SRK激酶域与Bo PUB3、Bo PUB9、Bo PUB43及ARC1的臂重复结构域发生相互作用,且相互作用强度为Bo PUB9>Bo PUB3≈Bo PUB43>ARC1。SRK与Bo PUB44和Bo PUB34均不能发生相互作用。表达分析发现Bo PUB3基因主要在柱头中表达,在自花授粉15 min,30 min和60 min处理后,表达量显著降低,而Bo PUB9和Bo PUB43在所有组织中都表达,我们推测Bo PUB3极有可能作为SRK下游靶蛋白参与自交不亲和反应。(3)甘蓝MLPK同源基因MLPKn1的克隆及表达分析以甘蓝“A4”材料gDNA和柱头cDNA为模板,通过高保真DNA聚合酶扩增得到MLPK的三个转录本Bo MLPKf1、Bo MLPKf2和Bo MLPKn1。Bo MLPKf1cDNA大小为1215bp,编码404个氨基酸,Bo MLPKf2 cDNA大小为1233bp,编码410个氨基酸。Bo MLPKn1为新获得的转录本,其cDNA大小为1257bp,编码418个氨基酸。Bo MLPKf1和Bo MLPKf2编码的氨基酸之间只有N端不同,Bo MLPKf1和Bo MLPKn1N端均存在典型的豆蔻酰化模体,Bo MLPKf2 N端为疏水结构域。和Bo MLPKf1/2相比,Bo MLPKn1有两个插入序列,一个是在1,102-1,114bp之间有12 bp的插入,另一个是在1,152-1,182 bp之间有30 bp的插入。甘蓝三个MLPK转录文本均具有一个高度保守的Ser/Thr蛋白激酶结构域。利用半定量分析发现Bo MLPKf1和Bo MLPKn1基因在甘蓝的叶片、花瓣、萼片、雄蕊和柱头中均有表达,Bo MLPKf2在柱头中特异表达。q RT-PCR检测发现自花授粉后Bo MLPKf2相对表达量急剧升高,而15 min后开始急剧下降。Bo MLPKf1和Bo MLPKn1在自花授粉后表达量均略有升高,但变化不显著。利用瞬时表达检测Bo MLPKn1和Bo MLPKf1一样定位在细胞膜上,通过Bi FC技术检测Bo MLPKn1与SRK、ARC1均能在细胞膜上发生相互作用。通过线性分析发现芸薹属MLPKn1基因是拟南芥At APK1b的直系同源基因,而不是以前报道的MLPKf1/2基因。MLPKf1/2基因是在芸薹属和拟南芥物种分化之后出现的,在芸薹属物种中通过与SRK互作引起自交不亲和级联反应,MLPKn1基因在整个十字花科进化中是高度保守的,且不参与自交不亲和反应。(4)MLPKn1拟南芥同源基因At APK1b的功能研究MLPKn1基因是拟南芥AtAPK1b的直系同源基因,根据AtAPK1b的gDNA序列特征在第一个外显子和第三个外显子处设计两个sg RNA位点,并合成sg RNA引物,构建p UC119-At U6-g RNA载体,进而将重组载体连接到Cas9-p G626表达载体中,转化农杆菌GV3101感受态细胞,通过花序侵染法转化拟南芥,获得T0代种子,用0.03%Basta筛选获得T1代转基因植株。经过T1代筛选和PCR测序检测共获得13个拟南芥At APK1b突变单株系。其中有碱基缺失长度为21-509 bp的突变,也有额外碱基插入和碱基突变的现象。观察T1代转基因拟南芥初步表型,发现转基因拟南芥较野生型相比,植株矮小,长势较弱,但能够正常开花结子。(5)S-位点受体激酶相关因子在亲和突变材料中编码序列分析以高度自交亲和“Yellow sarson”材料和不亲和结球甘蓝“A4”材料柱头cDNA为模板,扩增其SRK、MLPK、ARC1和Exo70A1基因编码序列,并以花药cDNA为模板扩增SCR基因编码序列。结果发现各个材料中S-位点受体激酶相关因子均具有完整的编码序列,通过对SCR和SRK基因序列比对发现,甘蓝“A4”材料与甘蓝S28单倍型序列一致,“Yellow sarson”材料与白菜f2单倍型序列一致。氨基酸序列比对发现Bo SRKA4与Br SRKB的一致性为99%,与Br SRKQ之间的一致性为97%。Bo SCR与Br SCRB和Br SCRQ之间的一致性均为92%,有5个氨基酸的差异,Bo ARC1与Br ARC1Q和Br ARC1B的一致性均为93%,Bo Exo70A1与Br Exo70A1B和Br Exo70A1Q之间的序列一致性均为99%,只有一个氨基酸的差异。说明SCR、SRK、ARC1和Exo70A1基因在甘蓝“A4”材料和“Yellow sarson”材料中具有较高的保守性。比较两种材料MLPK氨基酸序列发现,“Yellow sarson”材料的Br MLPKf1/2与甘蓝的Bo MLPKf1/2相比,有6个氨基酸的差异,即Bo MLPKf1中K116-R,L183-I,G194-R,S288-N,T350-N,A365-E。根据前人的研究报道,MLPK的G194突变为R后MLPK不具有自体磷酸化活性。因此,两类材料自交亲和性与SCR、SRK、MLPKn1、ARC1和Exo70A1基因序列差异没有直接的关联,但是否是由MLPK基因的突变引起有待进一步研究。(6)恢复MLPKf2基因的表达对“Yellow sarson”材料自交亲和性的影响由于“Yellow sarson”材料中MLPK发生突变,MLPKf2在柱头中特异表达。为了检测恢复MLPKf2基因的表达对“Yellow sarson”材料自交亲和性产生的影响,我们根据MLPKf2基因的全长序列,结合植物双元载体p CAMBIA1300多克隆位点,设计含酶切位点的引物,构建SLR柱头特异性启动子的超表达载体p CAMBIA1300-MLPKf2,通过农杆菌介导法将上述表达载体转化“Yellow sarson”下胚轴和子叶,经预培养、侵染、暗培养、愈伤分化、不定芽增值、生根、移栽等过程,获得“Yellow sarson”转基因植株。提取转基因植株基因组DNA进行PCR检测,结果均能检测到正确的目的片段。通过q RT-PCR检测MLPKf2在转基因植株中的表达水平,结果均能检测到MLPKf2基因的超量表达,说明MLPKf2成功整合到转基因植株中DNA。表型观察发现野生型植株所结种荚正常生长伸长,且多数种荚中可见明显突起,而转基因植株种荚短小、干瘪,几乎看不见突起的籽粒,并且种荚死亡情况严重。说明恢复MLPKf2的表达能部分恢复“Yellow sarson”材料的自交不亲和性。