【摘 要】
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我们前期的研究结果表明,40日龄SPF健康鸡和J亚群禽白血病（ALV-J）患病鸡的脾脏组织中存在7个差异显著表达的miRNA。因此,本试验以此为基础,通过对7个差异表达的miRNA进行生物信息学分析,最终选定gga-miR-148a-5p作为研究对象。我们预测筛选出PDPK1可能为gga-miR-148a-5p的靶基因,并通过干扰、过表达、CCK-8、Ed U、流式细胞术、双荧光素酶报告基因试验和
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我们前期的研究结果表明,40日龄SPF健康鸡和J亚群禽白血病（ALV-J）患病鸡的脾脏组织中存在7个差异显著表达的miRNA。因此,本试验以此为基础,通过对7个差异表达的miRNA进行生物信息学分析,最终选定gga-miR-148a-5p作为研究对象。我们预测筛选出PDPK1可能为gga-miR-148a-5p的靶基因,并通过干扰、过表达、CCK-8、Ed U、流式细胞术、双荧光素酶报告基因试验和EMSA等分子和细胞生物学手段,阐明了gga-miR-148a-5p靶向PDPK1调控J亚群禽白血病致病的分子作用机制。试验结果如下:（1）双荧光素酶报告基因试验表明PDPK1是gga-miR-148a-5p的靶基因,两者存在靶标调控关系。（2）荧光定量结果表明,过表达和抑制gga-miR-148a-5p后,PDPK1与gga-miR-148a-5p的m RNA表达水平呈负相关。（3）CCK-8检测结果表明,ALV-J可显著促进CEF细胞增殖（P<0.05）;干扰PDPK1和过表达gga-miR-148a-5p后,均能显著促进ALV-J感染的CEF细胞的增殖（P<0.05）;相反,抑制gga-miR-148a-5p 24h后,极显著抑制了ALV-J感染的CEF细胞的增殖（P<0.01）。（4）Ed U试验结果表明,与对照组相比,ALV-J感染的CEF细胞中Ed U阳性率显著增加（P<0.05）,过表达gga-miR-148a-5p和干扰PDPK1后,ALV-J感染的CEF细胞中Ed U阳性率显著增加（P<0.05）;相反,抑制gga-miR-148a-5p后,ALV-J感染的CEF细胞中Ed U阳性率显著降低（P<0.05）。上述结果表明,在ALV-J感染的CEF中,gga-miR-148a-5p可通过靶向调控PDPK1促进细胞增殖。（5）细胞周期结果表明,与对照组相比,ALV-J感染组中G2和S期的细胞比例比显著增加（P<0.05）,G1期细胞比例减少;过表达gga-miR-148a-5p和干扰PDPK1后,ALV-J感染组G2和S期的细胞比例显著增加（P<0.05）,而G1期细胞比例减少;相反,抑制gga-miR-148a-5p后,G2和S期的细胞比例显著减少（P<0.05）,而G1期细胞比例增加。上述实验结果表明:在被ALV-J感染的CEF中,gga-miR-148a-5p可通过靶向调控PDPK1促进细胞周期进程。（6）双荧光素酶报告基因试验和EMSA试验表明,与对照组相比,ALV-J处理和PDPK1干扰处理对ALV-J感染的CEF NF-κB的活性无显著影响。综上所述,在ALV-J感染CEF的条件下,gga-miR-148a-5p可以通过下调PDPK1促进ALV-J诱导的细胞增殖和细胞周期进程。同时,在ALV-J感染CEF的条件下,ALV-J及PDPK1干扰对CEF中NF-κB的活性无显著影响。
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