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目的:通过设计构建过表达Dectin-1慢病毒,建立Dectin-1基因过表达的巨噬细胞RAW264.7与马尔尼菲篮状菌(Talaromyces marneffei,TM)共培养模型,研究过表达的Dectin-1基因以及Curdlan在巨噬细胞RAW264.7对抗马尔尼菲篮状菌感染中的作用。方法:(1)根据目的基因Dectin-1序列设计引物,扩增目的基因片段,对目的基因片段以及目的载体进行酶切、连接,构建过表达Dectin-1慢病毒载体质粒;共转染293T细胞包装重组过表达Dectin-1慢病毒载体质粒,72 h后收集病毒,孔稀释法测定重组过表达Dectin-1慢病毒的滴度;在体外条件下,阳性过表达Dectin-1慢病毒及阴性对照慢病毒转染巨噬细胞RAW264.7(阳性、阴性分别命名为RAW-Posi及RAW-Neg,未做处理的命名为RAW-Ctrl),荧光显微镜下观察慢病毒转染效果,荧光定量PCR法测定Dectin-1基因mRNA的相对表达量。(2)构建RAW264.7与马尔尼菲篮状菌共培养的体外模型,分别在24 h及48 h停止共培养,用平板菌落计数计算杀灭百分数检测RAW264.7对TM孢子的杀伤能力;用酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测共培养上清液中反应性活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)、一氧化氮(Nitric Oxide,NO)、TNF-α、IL-1β、IL-4 和 IL-10的含量;用钙荧光白染液染色法,观察RAW264.7内马尔尼菲篮状菌孢子的形态变化。通过荧光定量PCR测定巨噬细胞感染前后iNOS以及Arg-1的mRNA的表达情况。结果:(1)经过酶切结果以及PCR鉴定结果证实构建的慢病毒载体质粒含有目的基因Dectin-1;过表达Dectin-1慢病毒的滴度为:3.12*109 Tu/ml;慢病毒转染细胞后72h,荧光显微镜下可以观察到细胞荧光表达程度高,RAW-Posi中目的基因Dectin-1的mRNA表达量明显高于RAW-Ctrl及RAW-Neg,差异有统计学意义P<0.05。(2)①菌落计数计算杀灭百分数结果提示:共培养48 h,细胞对TM孢子的杀灭百分数高于共培养24 h,差异有统计学意义P<0.05;RAW-Posi对TM孢子的杀灭百分数高于RAW-Ctrl及RAW-Neg,差异有统计学意义P<0.05;添加Curdlan预处理巨噬细胞后,细胞对TM孢子的杀灭百分数高于未添加Curdlan,差异有统计学意义P<0.05。②ELISA检测上清液因子结果提示:共培养48 h上清液中ROS浓度高于24h,差异有统计学意义P<0.05,而NO、TNF-α、IL-1β、IL-4及IL-10浓度随时间变化差异没有统计学意义P>0.05;RAW-Posi与TM共培养体系中ROS、NO及TNF-α浓度高于RAW-Ctrl及RAW-Neg,差异有统计学意义P<0.05,而三组细胞与TM共培养体系中IL-1β、IL-4及IL-10的浓度变化差异没有统计学意义P>0.05;添加Curdlan预处理细胞与TM共培养体系中ROS、NO、TNF-α及IL-1β的浓度高于未添加Curdlan,差异有统计学意义P<0.05,而添加Curdlan预处理细胞与TM共培养体系中IL-4及IL-10的浓度与未添加Curdlan比较,差异没有统计学意义P>0.05。③荧光定量PCR检测共培养体系中巨噬细胞iNOS及Arg-1的mRNA相对表达量提示:同一处理条件下,巨噬细胞与TM共培养48 h体系中iNOS及Arg-1基因的mRNA表达水平均高于24h,差异有统计学意义P<0.05;RAW-Posi与TM共培养体系中iNOS及Arg-1的相对表达量高于RAW-Ctrl及RAW-Neg,差异有统计学意义P<0.05;添加Curdlan预处理细胞与TM共培养体系中iNOS的mRNA相对表达量高于未添加Curdlan比较,差异有统计学意义P<0.05;而添加Curdlan预处理细胞与TM共培养体系中Arg-1的mRNA相对表达量与未添加Curdlan比较,差异无统计学意义P>0.05,除外共培养48 h时,添加Curdlan预处理RAW-Posi与TM共培养时Arg-1的mRNA相对表达量低于未添加Curdlan预处理RAW-Posi与TM共培养,差异有统计学意义P<0.05。结论:(1)慢病毒能够介导巨噬细胞RAW264.7过表达Dectin-1。(2)过表达Dectin-1及Curdlan在巨噬细胞RAW264.7对抗TM感染过程中,能显著提高ROS、NO及促炎因子TNF-α、IL-1β的表达量,增强巨噬细胞RAW264.7对TM孢子的杀伤力。(3)过表达Dectin-1促进巨噬细胞RAW264.7在对抗TM过程中向M1及M2极化;Curdlan可能具有促进巨噬细胞RAW264.7向M1型极化的趋势。