甲真菌病是真菌引起的甲板和甲下组织的感染,是成人最常见的甲病之一,发病率高达12%,且随年龄的增加而增高,足趾较手指更常见。皮肤癣菌、酵母菌和霉菌均可引起甲真菌病,其中以皮肤癣菌中的红色毛癣菌感染最常见。临床表现为甲板呈黄白色或褐色、增厚、糠化等。不及时治疗可导致整个甲板的破坏,严重影响美观。更需要引起重视的是,该病具有传染性,较手足癣更为顽固难治,常常成为诱发皮肤癣菌病的传染源。由于局部抗真菌药很难穿透甲板起到杀菌作用,口服抗真菌药又不适合肝病患者、老年人等特殊人群,目前甲真菌病的治疗仍较为棘手。长脉宽1064nm Nd:YAG激光疗法是治疗甲真菌病的新方法,目前美国食品与药品管理局(Food and Drug Administration,FDA)已经认可了1064nm Nd:YAG激光在内的多种激光设备能够暂时性促进甲真菌病患者新甲的生长,近几年已有国内外学者研究证实了1064nm Nd:YAG激光治疗甲真菌病具有良好的疗效和安全性。以上新型激光治疗与以往口服药物和拔甲治疗相比,具有操作方便、安全性高、花费时间少、并不产生其他副作用的优势。但由于激光治疗甲真菌病的具体机制尚不明确,具体治疗方案也没有定论,此外,目前的研究病例数量偏少,缺乏激光对不同年龄、不同严重程度、不同足趾位置的病甲的疗效的研究。因此仍需要在这些方面进一步的探索和研究。目的：第一部分：观察接受长脉宽1064nm Nd:YAG激光照射的离体趾甲和未接受激光照射的离体趾甲真菌直接镜检、真菌培养的结果并观察病甲在扫描电镜下的形态以及附着于病甲表面的真菌菌丝及孢子形态,对比其差异；第二部分：应用长脉宽1064nm Nd:YAG激光治疗趾甲真菌病患者,探讨该治疗方法的疗效及安全性。方法：第一部分：收集由红色毛癣菌感染的离体趾甲样本60例,其中30例使用长脉宽1064nnmNd:YAG激光照射(照射参数设定为脉宽45ms,光斑直径3mm,频率2Hz,能量40-60J/cm2),另外30例不进行激光照射：第一组：分别取10个经过激光照射的趾甲和10个未经激光照射的趾甲行真菌直接镜检,观察光镜下是否可见真菌的菌丝或孢子；第二组：分别取10个经过激光照射的趾甲和10个未经激光照射的趾甲刮取甲屑行真菌培养,每个培养皿种四个点,放入26摄氏度的温箱内孵育,观察14-28天,比较菌落的生长数量；第三组：分别取10个经过激光照射的趾甲和10个未经激光照射的趾甲,各从中选取趾甲面积大,且相对平整的5个样本,制作成扫描电镜标本进行观察,比较激光照射后的趾甲形态以及趾甲表面附着真菌菌丝或孢子的形态；第二部分：对确诊的104例(461个趾甲)趾甲真菌病患者进行长脉宽1064nm Nd:YAG激光治疗。患者年龄10-90岁,为2011年4月至2014年7月在我科确诊为趾甲真菌病的患者,真菌直接镜检和培养结果均为阳性,临床表型包括白色浅表型、远端侧位甲下型、近端甲下型、全甲毁损型；甲真菌病临床评分指数(SCIO)为1-30。患者排除标准：(1)病人自动中止治疗或拒绝后续治疗；(2)在过去6个月内,患者已进行了系统性抗真菌药物治疗：(3)甲板及甲床有外伤史；(4)严重变色的甲； (5)妊娠期患者； (6)同时伴有其他临床疾病相关的不正常甲表现,如银屑病,扁平苔藓或特应性皮炎； (7)细菌感染导致的趾甲色素沉着。因不良事件而中断治疗时,在疗效分析中排除该类病例,但纳入不良反应发生率的统计中。对确诊的104例(461个趾甲)趾甲真菌病患者,根据年龄段分为Ⅰ组(≥60岁)和Ⅱ组(<60岁),分别为211名患者和250名患者；按照SCIO评分分为A,组(SCIO<6),B,组(6≤SCIO<12),C,组(12<SCIO<18),D,组(SCIO≥18);按病甲位置分为αⅠ组(第1趾甲),βⅠ组(第2-4趾甲),θⅠ组(第5趾甲)；Ⅱ组(<60岁)共40名患者,250个趾甲,按SCIO评分分为AⅡ组(SCIO<6),BⅡ组(6≤SCIO<12),CⅡ组(12≤SCIO<18),DⅡ组(SCIO≥18);按病甲位置分为αⅡ组(第1趾甲),pⅡ组(第2-4趾甲),θⅡ组(第5趾甲)。采用以色列飞顿·辉煌360(Harmony(？)XL, Alma Lasers Ltd)长脉宽1064nmNd:YAG激光治疗手具对104名患者(共461个病甲)进行治疗。激光参数：脉宽45ms,光斑直径3mm,频率2Hz,能量40-60J/cm2。能量大小根据患者甲板厚度、病人的耐受和病情严重程度适量调整,每周行1次激光治疗,共10-12周。治疗时每个病甲照射3轮,每轮激光照射时确保激光光斑覆盖全部病甲范围,光斑可有小面积重叠,间隔时间2分钟。治疗前削薄增厚的病甲,并记录患者的年龄、性别、病甲位置、SCIO评分,对每个病甲进行拍照存档,取每位患者临床表现最典型的一个病甲行真菌镜检及培养。分别于初次治疗后的24周、48周对所有患者进行随访,并拍照、对相同位置病甲再次行真菌镜检及培养。所有病甲照片、真菌直接镜检、真菌培养结果由未参与治疗的医生专人负责,统一进行操作并评价。临床疗效的评价标准参考Arisa E. Ortiz等人的五等级评价标准：显著有效—病甲清除>75%；中等有效—病甲清除50%-75%；好转—病甲清除25%～49%；略好转—病甲清除<25%；无效—病甲无变化或加重。临床有效率=(显著有效例数+中等有效例数)／总例数×100%；真菌学疗效标准：痊愈—真菌培养及镜检阴性；未愈—真菌培养或镜检阳性。真菌学有效率=痊愈例数／总例数×100%；数据采用SPSS20.0统计软件进行分析。根据患者的年龄、SCIO评分、病甲位置不同分组,采用自身对照的方法进行多个样本率的比较,运用卡方检验,比较不同分组的临床有效率及真菌学有效率有无统计学差异,P值<0.05表示差异有统计学意义。结果：第一部分：1、真菌直接镜检：通过光学显微镜观察未激光照射的病甲所刮下的甲屑,10个病甲检查结果全部阳性。通过光学显微镜观察激光照射后病甲所刮下的甲屑,10个病甲中有2个直接镜检为阳性,可清晰的在光镜下看到菌丝,其余8个直接镜检结果为阴性。2、真菌培养：未经激光照射的病甲所接种的10个培养皿在26-C温箱培养至14-28天,培养结果分别为3个点阳性、3个点阳性、2个点阳性、4个点阳性、2个点阳性、1个点阳性、3个点阳性、4个点阳性、3个点阳性、4个点阳性,菌落生长情况良好,真菌培养的阳性率为72.5%(29/40)。经激光照射后的病甲所接种的10个培养皿在26℃温箱培养至14-28天,培养结果分别为1个点阳性、0个点阳性、1个点阳性、0个点阳性、0个点阳性、1个点阳性、0个点阳性、2个点阳性、0个点阳性、1个点阳性,真菌培养的阳性率为15%(6/40)。3、扫描电镜观察：未经激光照射的病甲部分呈层状,可见菌丝有分支,部分可见孢子。激光照射后的病甲上所附着的菌丝和孢子的数量明显减少,甲板结构不规则,鳞屑较多。虽然病甲的大体外观并未发生改变,但是对病甲的超微结构有一定的影响。第二部分：1、临床症状明显改善共治疗104例患者,平均年龄50.44岁,Ⅰ组平均年龄为70.48岁,Ⅱ组平均年龄为33.52岁。24周和48周随访时,由随访时所拍摄的照片可看出大部分患者的临床症状可明显改善。2、不同年龄组的临床有效率及真菌学治愈率比较Ⅱ组的临床有效率在24周时高于Ⅰ组,差异有统计学意义(χ2=29.33,P<0.05)；48周时也高于Ⅰ组(χ2=20.95,P<0.05),差异有统计学意义。Ⅱ组的真菌学治愈率在24周时高于Ⅰ组(χ2=5.48,P<0.05)、48周时亦高于Ⅰ组(χ2=6.09,P<0.05),差异有统计学意义。3、病甲严重程度不同的临床有效率比较在24周时,AⅠ、BⅠ、CⅠ、DⅠ组间的临床有效率差异无统计学意义(χ2=9.13,P>0.05),AⅡ、BⅡ、CⅡ、Du组间的临床有效率差异也无统计学意义(χ2=7.99,P>0.05)。48周时,除DI组以外,AⅠ、BⅠ、CⅠ组的临床有效率均有不同程度的提高,但各组的临床有效率差异无统计学意义(χ2=2.23,P>0.05),AⅡ、BⅡ、 CⅡ、DⅡ组的临床有效率较24周时分别有不同程度的提高,但各组之间的临床有效率差异无统计学意义(χ2=9.13,P>0.05)。4、不同位置趾甲的临床有效率比较24周时,p,组的临床有效率高于αⅠ、θⅠ组(χ=23.42,P<0.05),βⅡ组的临床有效率高于αⅡ、θⅡ组(χ2=30.64,P<0.05),差异均具有统计学意义；48周时,β1组的临床有效率高于αⅠ、θⅠ组(χ2=18.61,P<0.05),βⅡ组的临床有效率高于αⅡ、θⅡ组(χ2=32.80,P<0.05),差异均有统计学意义。5、不良反应整个48周的观察期内未出现患者因严重不良反应而退出治疗的情况,部分患者在激光治疗时出现疼痛,但均可耐受。结论第一部分：1、长脉宽1064m Nd:YAG激光对离体病甲(趾)中的红色毛癣菌起到一定的抑制或杀灭作用,但具体的抑制作用时间仍不明确,对其穿透趾甲的深度仍需要进一步探索；2、长脉宽1064m Nd:YAG激光对趾甲的大体外观形态影响不大,扫描电镜下可见对其微观结构形态有影响,但是这并不影响趾甲的生理功能,该疗法可以作为一种治疗甲真菌病的安全的方法。第二部分：1、小于60岁患者的临床有效率和真菌学治愈率均优于大于等于60岁者,这与老年人趾甲生长速度慢、末梢循环下降和抵抗力相对差有一定关系,所以我们推荐在治疗过程中可适当给予改善趾甲末梢循环的维生素E等,以及可以促进甲生长的维生素A、B2等。2、从不同严重程度亚组的结果可见,该方法可使SCIO评分1-30的病甲均达到较好的治疗效果,进一步证实了该激光治疗的有效性。3、αⅠ、θⅠ、αⅡ、θⅡ组的有效率欠佳,提示各年龄段患者的第1趾甲和第5趾甲都需要延长疗程,以达到更高的临床有效率。4、本研究中,患者均接受每周1次,连续10-12次的治疗,24周时的临床有效率为59.0%,48周时为72.5%。我们的临床有效率并不如国外文献所报道的有效率高,原因可能与病例数多、病情严重程度差异以及本研究中老年患者所占比例较大有关。5、本研究48周的临床有效率均高于24周,可能是因为我们的治疗次数较多,有效地破坏了病原真菌,减少了“再燃”的可能性：并同时外用药治疗合并的手足癣、体癣,减少了自身再感染的机会。6、我们在趾甲增厚的患者激光治疗前都进行了病甲磨薄,使激光能够充分穿透病甲进而提高了疗效。甲真菌病的微创激光疗法仍然是一个处于起步阶段的新技术,尽管已有一些关于应用长脉宽1064nmNd:YAG激光治疗的报道,但是仍缺乏明确的治疗指南,对于疗程时长以及不同病情严重程度的患者,具体的治疗方案仍然需要大量的临床经验积累及临床实践数据来完善。