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RNA沉默是植物抵御病毒侵染的一种防卫机制,其本质是转录后的基因沉默（PTGS）,一般由dsRNA引发。体外构建的hpRNA可以高效地诱发基因沉默。一个病毒基因组编码多种功能蛋白,不同的蛋白在病毒复制、增殖和传播等过程中有着不同的功能,干扰不同基因表达可能诱发不同的基因沉默效果。本研究以马铃薯Y病毒坏死株系（PVYN）的RNA为模板,利用反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）方法,克隆了NIa-Vpg、NIa-Pro基因;进而利用PCR扩增了NIa-Vpg、NIa-Pro、NIb和CP等4个基因的3′端400bp和500bp片段,反向插入到双元表达载体pROKII中,构建了4个hpRNA结构的植物表达载体。通过根癌农杆菌（LBA4404）介导的方法转化烟草NC89,经卡那霉素抗性筛选、PCR检测,获得了转基因植株。大分子RNA和siRNA的Northern blot分析表明,目的片段转录产物的积累量与植株的抗病性呈负相关,可检测到siRNA,证明所获得的抗病性是RNA介导的抗病性。研究结果对于将来有效地选择靶位点序列和成功应用RNA介导的病毒抗性策略提供依据,具有重大指导意义。具体结果如下:1.利用RT-PCR技术,分别克隆PVYN的NIa-Vpg、NIa-Pro基因;进而利用PCR扩增了NIa-Vpg、NIa-Pro和NIb、CP（由实验室前期克隆）等4个基因3′端的400bp和500bp片段,分别插入到双元表达载体pROKⅡ中,构建茎长度为400bp,环长度100bp的发夹结构的植物表达载体pROKⅡ-NIa-Vpg、pROKⅡ-NIa-Pro、pROKⅡ-NIb、pROKⅡ-CP。2.将所构建的植物表达载体pROKⅡ-NIa-Vpg、pROKⅡ-NIa-Pro、pROKⅡ-NIb、pROKⅡ-CP及空pROKⅡ利用冻融法直接导入农杆菌LBA4404。菌液PCR及酶切鉴定证明质粒均已成功导入农杆菌菌株。3.叶盘法转化烟草NC89。经卡那霉素对再生植株再次抗性筛选、PCR检测,共获得转pROKⅡ的烟草34株,转NIa-Vpg的烟草126株,转NIa-Pro的烟草101株,转NIb的烟草100株,转CP的烟草132株。4.以PVYN的病汁液为接种物,汁液摩擦接种转基因烟草,对转基因植株进行了抗病性分析。症状观察及ELISA检测表明不同的转基因植株对PVYN的抗性存在着差异。在126株转NIa-Vpg的T0代烟草中,有82株表现高度抗病,抗性植株比例为65.08%;101株转NIa-Pro的T0代烟草中,有59株表现高度抗病,抗性植株比例为58.42%;100株转NIb的T0代烟草中,有43株表现高度抗病,抗性植株比例为43.00%;132株转CP的T0代烟草中,有84株表现高度抗病,抗性植株比例为63.64%。5.转基因植株的Northern blot分析表明,转基因都在RNA水平上得到了表达,抗病性与转基因转录产物的积累量二者呈负相关,即这种抗病性为RNA介导的抗病性,是RNA沉默的结果。6.转基因植株siRNA的杂交分析显示,抗病植株中均检测到siRNA的存在。