狂犬病（Rabies）是由狂犬病毒(Rabiesvirus)引起的，一种侵害中枢神经系统的传染病。狂犬病病毒属于弹状病毒科（Rhabdoviridae）中的狂犬病毒属（Lyssavirus）。狂犬病流行已经有三千年历史，世界上80多个国家仍有发生，尤其是在亚洲和非洲，狂犬病的发病率和死亡率超过其它类型的传染病。全世界每年有50000~55000人死于狂犬病，病例绝大部分集中在发展中国家。我国每年就有3000人死于狂犬病。目前人狂犬病的传播和贮存宿主以犬为主，我国每年死亡的3000人中，95%以上是由于犬感染引起。带毒动物的咬伤是狂犬病传播的主要途径。控制乃至消灭狂犬病的最好方法就是预防接种。目前广泛应用的传统灭活疫苗，能够很好的预防和控制狂犬病。但是价格昂贵，免疫成本高，暴露后需要多次免疫等问题，不利于在发展中国家应用。因此，迫切需要研制免疫效果好、廉价并能一次免疫就能达到免疫保护的新型疫苗。伪狂犬病毒（Pseudorabiesvirus,PRV）是一种极具开发潜力的疫苗载体。PRV基因组为线性双链DNA，长度约143kb，遗传稳定性好；并含有许多病毒复制的非必需基因（TK，gI，gE，gG，PK），外源基因容量大；基因组具有感染性，转染细胞后即可开始复制，产生高滴度子代病毒；PRV具有广泛的宿主范围，可以感染猪、犬、牛、羊等多种家畜和野生动物，但不感染人。[3,4]本试验利用Tn5转座子介导的方法，构建了一株同时表达SRV9糖蛋白和EGFP绿色荧光蛋白的重组伪狂犬病毒，并且利用该重组病毒进行了猫的免疫研究。第一，本试验构建了同时表达SRV9糖蛋白和EGFP的双表达盒：先将SRV9糖蛋白基因连入pcDNA3.1（+）载体多克隆酶切位点，得到p3.1-SRV9G。再将EGFP表达盒从pEGFP-N1载体上切下，连入p3.1-SRV9G中，取代原来的Neo抗性基因。从而得到了含有能同时表达SRV9G和EGFP的双表达盒的质粒p3.1-SRV9GEGFP。第二，构建含有双表达盒的转座质粒：用MluI、SalI双酶切切下SRV9糖蛋白和EGFP双表达盒，克隆进Tn5转座子载体pUCMOD的多克隆酶切位点中，得到转座质粒pUCMOD-SRV9GEGFP。第三，通过转座和转染的方法得到能同时表达SRV9G和EGFP的重组病毒：用PacI将转座片段释放出来，回收后与PRVBartha株基因组转座2小时，转座产物再转染BHK细胞，细胞病变，得到重组病毒库。再将冻融后的病毒接种BHK细胞，2小时后覆盖低熔点琼脂糖，48小时后在荧光显微镜下挑取单个荧光斑，接到新的BHK细胞中，进入新一轮筛选。如此重复6轮，再用有限稀释法亚克隆重组病毒3次，就会得到纯化好的重组病毒rPRV/SRV9G/EGFP。重组病毒rPRV/SRV9G/EGFP的鉴定：（1）插入位点的鉴定，证明插入位点在Bartha株的gI基因中，gI基因在Bartha株中部分缺失，插入片段位于gI基因残余序列上，理论上对病毒毒力和增殖不会有太大的影响；（2）外源基因的转录、表达及遗传稳定性的鉴定，证明重组病毒表达的外源蛋白均能与RV阳性血清发生特异性反应，且两株重组病毒在传代30代后，外源基因未发生丢失，并可在感染的细胞内有效的转录和表达，具有良好的遗传稳定性；（3）形态结构和增殖稳定性的鉴定，证明重组病毒依然保持着典型的疱疹病毒形态结构特征，增殖能力没有发生改变。重组病毒rPRV/SRV9G/EGFP肌肉注射和口服免疫猫的试验证明：（1）两种途径均能诱导机体产生细胞免疫和体液免疫，从第四周起抗狂犬病病毒中和抗体的水平即高于0.5IU/mL，而针对PRV的中和抗体滴度在1：64～1：128之间，且均可维持18周以上；（2）肌肉注射免疫的效果比口服免疫的效果好，但口服免疫也能产生具有足够保护力的抗狂犬病病毒的中和抗体，提示该重组病毒有作为口服疫苗应用的潜力；（3）免疫猫体温正常，精神状态良好，重组病毒只在粪便中短期检出，尿液中无重组病毒。因此初步的安全性评价证明，该重组病毒在犬科动物体内基本安全、有效，后期还需要进一步进行安全性评价，对本重组疫苗病毒的安全性做出更全面的评估。综上，本研究利用转座方法获得了表达RV糖蛋白的重组病毒rPRV/SRV9G/EGFP，并对重组病毒进行了生物学特性和免疫学试验的研究，结果显示该重组病毒可以通过肌肉注射和口服免疫两种途径诱导受试猫机体产生针对RV的具有保护水平的中和抗体，初步的安全性评价也未发现其对受试猫有毒害作用。从而提示转座方法可以作为一种简单、有效的技术应用于重组病毒疫苗的开发中，而得到的重组病毒rPRV/SRV9G/EGFP有作为备选口服疫苗的潜力，对控制狂犬病在猫科动物间特别是流浪猫间的传播起到积极作用。