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为了探讨雌性类固醇激素孕酮(Progesterone,P4)和雌二醇(Estradiol,E2)与肠道菌群的互作机制,本论文比较分析了梅山母猪妊娠30 d和妊娠90 d粪便中的类固醇激素(P4、E2)、细菌区系及代谢物的变化,同时通过体外厌氧培养的方法,进一步分析P4和E2对粪便菌群的影响。1梅山母猪妊娠期类固醇激素、细菌区系和代谢物的变化梅山母猪妊娠30 d粪样中P4和E2的浓度均极显著低于妊娠90 d(P<0.01)。Illumina PE250测序目水平上分析结果表明,妊娠30 d粪样中的Burkholderiale和Selenomonadales相对丰度显著低于妊娠90 d(P<0.05)。属水平上分析结果表明妊娠30 d的Lachnospiraceae UCG-007、Pseudomonas的相对丰度显著高于妊娠90(P<0.05),而 Anaerotruncus、Candidatus Soleaferrea、Phascolarctobacterium、Prevotellaceae UCG-004、Intestinibacter、[Eubacterium]coprostanoligenes group相对丰度显著低于妊娠90 d(P<0.05)。但妊娠30 d和90 d的细菌区系丰度指数(Ace和Chao)、多样性指数(Shannon和Simpson)均无显著性差异。粪代谢组学分析结果显示,妊娠30 d到妊娠90 d母猪粪便中有11种代谢物的含量有显著差异(P<0.01),主要涉及氨基酸代谢途径(1个)、脂类代谢途径(6个)、碳水化合物代谢途径(3个)及维生素代谢途径(1个)。说明,随着粪便中P4和E2浓度的升高,粪便细菌区系结构也发生变化。2孕酮与猪粪细菌区系的互作关系研究为了分析P4与肠道细菌区系的互作机制,本试验用不同浓度梯度(0.2、2、4、8 μg/mL)P4进行猪粪菌群体外37℃厌氧培养,同时设空白对照组(ControlⅠ)和与各处理组等量的二甲亚砜(Dimethyl Sulfoxide,DMSO)对照组(对照组Ⅱ,Control Ⅱ),培养8 h后,对照组Ⅰ和对照组Ⅱ培养液短链脂肪酸(short chain fatty acids,SCFAs)含量及总菌数量无显著差异,说明每87 mL培养体系中含有的27.84 μL DMSO对粪便微生物区系没有产生影响。0.2～8μg/mL P4处理组OD630均显著高于Control Ⅱ组(P<0.05),其中2 μg/mL P4组显著高于其它各组(P<0.05)。q-PCR结果显示,0.2～8μg/mLP4处理组总菌数均极显著高于Control Ⅱ组(P<0.01),其中2 μg/mLP4组极显著高于其它各组(P<0.01)。说明,P4有促进细菌增殖的作用。2 μg/mLP4组乙酸、异丁酸、异戊酸、戊酸及总酸的含量显著高于Control Ⅱ组(P<0.01),但其中丙酸、丁酸含量显著低于Control Ⅱ组(P<0.05)。说明,2μg/mL P4影响细菌区系的代谢类型。Illumina Miseq PE250高通量测序结果表明,2 μg/mL P4处理组OTUs、Ace、Chao与Control ⅡI组相比无显著差异。2 μg/mLP4处理组的Shannon值极显著高于Control Ⅱ组,而Simpson值极显著低于Control Ⅱ组(P<0.01)。门水平上分析结果表明,2 μg/mL P4处理组Firmicutes相对丰度极显著低于Control Ⅱ组(P<0.01),Proteobacteria相对丰度极显著高于Control Ⅱ组(P<0.01)。属水平上分析结果表明,2 μg/mL P4 组 Enterobacter、Escherichia-Shigella 极显著高于Control Ⅱ组(P<0.01)。而 Achrmobacter、Pseurococcus、Pseudomonas、Ruminococcaceae UCG-005 和 Streptococcus 显著低于 Control Ⅱ 组(P<0.05)。说明2 μg/mL P4处理影响了粪便细菌区系的结构。P4在培养液中消减率由高到低依次为2、4、8、0.2 μg/mLP4组,其中2 μg/mL P4组显著高于其它各组(P<0.05)。4 μg/mL P4组极显著高于0.2、8 μg/mL P4组(P<0.01)。0.2 μg/mL P4组与8 μ/mL P4组相比差异不显著。说明细菌对P4的利用和分解呈剂量依赖型。3雌二醇与猪粪细菌区系的互作关系研究为了分析E2与肠道细菌区系的互作机制,本试验用不同浓度梯度的E2(20、40、60、120 ng/mL)进行猪粪菌群体外37 ℃厌氧培养,同时设空白对照组(对照组Ⅰ,Control Ⅰ)和与各处理组等量DMSO的对照组(对照组Ⅱ,Control Ⅱ)分别进行体外37℃厌氧培养猪粪菌群,经8 h培养后,对照组Ⅰ和对照组Ⅱ培养液SCFAs含量及总菌含量无显著差异,说明每87 mL的培养体系中含有的0.42μL DMSO对粪便微生物区系没有产生影响。40、60、120 ng/mL E2 组 OD630 均显著低于 Control @ 组(P≤0.05),其中 120 ng/mL E2组OD630极显著低于其他各组(P<0.01)。q-PCR结果显示,60、120 ng/mL E2组总菌数均极显著低于Control Ⅱ组(P<0.01),其中120ng/mLE2组极显著低于其它各组(P<0.01)。说明,E2可抑制粪便中细菌的增殖,且抑制作用随着E2剂量的增加而增加。120 ng/mLE2组乙酸、丁酸、异丁酸及总酸的含量极显著低于Control Ⅱ组(P<0.01);异戊酸含量极显著高于Control Ⅱ组(P<0.01);但两组间丙酸及戊酸含量差异不显著。说明,120ng/mLE2影响细菌区系的代谢类型。E2在培养液中消减率由高到低依次为120、20、60 ng/mL E2组,其中120 ng/mL E2组极显著高于其它各组(P<0.01);20 ng/mL E2组与60 ng/mL E2组之间差异不显著。说明细菌对E2的利用和分解存剂量性差异。Illumina Miseq PE250高通量测序结果表明,120 ng/mL E2处理组OTUs显著低于 Control Ⅱ组(P<0.05),但两组间 Ace、Chao、Shannon 和 Simpson 差异不显著。门水平上的分析结果表明,120 ng/mL E2组Bacteroidetes相对丰度极显著低于Control Ⅱ组(P<0.01);Proteobacteria相对丰度极显著高于Control Ⅱ组(P<0.01)。属水平上的分析结果表明,120 ng/mL E2组Enterococcus、Macellibacteroides、Enterobacteriaceae_Unclassified 和 Kluyvera 显著高于 ControlⅡ 组(P<0.05),而Bacteroide 极显著低于 Control Ⅱ 组(P<0.01)。提示,120 ng/mL E2处理影响了粪便细菌区系的结构。总结:(1)母猪妊娠期后期粪便中的P4、E2含量显著高于妊娠前期,且细菌区系的结构和代谢产物存在明显差异;(2)雌性类固醇激素影响粪便细菌区系的结构和多样性,且这种作用因激素种类和剂量而异。创新点:本研究通过结合体内和体外培养的方法,首次揭示雌性类固醇激素(P4、E2)可影响粪便细菌区系的结构和多样性,且这种影响因激素的种类和剂量而异。