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Ⅵ型分泌系统(TypeⅥsecretion system)是2006年在霍乱弧菌中被定义的新型分泌系统,其广泛存在于革兰氏阴性菌变形菌门中,为15-20个保守结构基因构成的基因簇,主要组分可分为尾鞘、基座,该系统激活后可分泌效应因子至靶细胞体内,靶细胞多为真核细胞或细菌,T6SS在许多致病菌中与致病性或细菌间竞争相关。溶血素共调节蛋白(Hemolysin-coregulated protein,Hcp)可形成六聚环复合体,由此互相堆叠形成纳米管道,构成T6SS尾鞘的重要组分,其分泌至胞外常作为T6SS发挥功能的标志。Hcp在T6SS中既作为重要组分,也作为效应因子或其分子伴侣发挥作用。在肠外致病性大肠杆菌中,对T6SS的研究并不多,主要集中在新生儿脑膜炎大肠杆菌RS218和禽致病性大肠杆菌中,T6SS均影响菌株的致病能力。在肠聚集性大肠杆菌中,T6SS主要参与细菌间竞争过程。许多菌株都含有不止一套的T6SS,或T6SS基因簇中hcp基因存在多个拷贝,通常不同的T6SS基因簇或不同的hcp拷贝在菌体的生物活动中发挥不同的功能。本实验室对猪源肠外致病性大肠杆菌PCN033菌株进行全基因组测序,发现菌株染色体上存在24.6 kbp大小的T6SS基因簇,其中含有2个hcp基因,基因簇外部还有1个hcp,分别命名为hcp1、hcp2、hcp3。本实验室已构建了Δhcp3缺失株,并对其基本生物学特性进行了研究,制备了Hcp1多克隆抗体,本研究利用同源重组原理构建了Δhcp1、Δhcp2、Δhcp1Δhcp2Δhcp3缺失株,对其进行基本生物学特性的研究并与亲本菌株PCN033进行比较,主要内容包括以下几个方面:1.猪源肠外致病性大肠杆菌基因缺失株Δhcp1、Δhcp2、Δhcp1Δhcp2Δhcp3的构建参照PCN033全基因组测序结果设计引物,以亲本菌株基因组为模板分别扩增hcp1、hcp2的上下游同源臂,串联构建重组的自杀性质粒p RE112Δhcp1、p RE112Δhcp2。通过接合转移将重组质粒导入亲本菌中,菌体自身的同源重组酶参与同源重组,利用Cm抗性和蔗糖敏感性进行正反筛选。先筛选Cm抗性、蔗糖敏感的单交换子,将单交换子于无盐LB中传代,再筛选出无Cm抗性、蔗糖耐受的菌株,用检测引物对菌株进行PCR检测,扩出小片段的菌株即为目的缺失株。如此获得Δhcp1、Δhcp2、Δhcp1Δhcp2Δhcp3。2.Hcp2、Hcp3多克隆抗体的制备及鉴定参照PCN033全基因组测序结果设计引物,以亲本菌株基因组为模板扩增hcp2、hcp3基因全长,分别连接于p ET30a、p GEX原核表达载体上,转化于E coli./BL21(DE3)中进行诱导表达获得融合表达蛋白Hcp2-His、Hcp3-His。利用镍离子亲和层析柱对蛋白进行纯化,所得目的蛋白作为免疫蛋白,免疫2月龄日本大耳兔,免疫完成后采取少量血清进行Western Blot检测,确定所制备的血清具有特异性,心脏采血日本大耳兔,收集血清置-80℃备用。3.猪源肠外致病性大肠杆菌hcp家族基因缺失株及亲本株细菌间竞争能力研究将缺失株及亲本株为捕食菌,以大肠杆菌K12菌株W3110为被捕食菌,捕食菌与被捕食菌互作后,对存活的W3110计数,以W3110的存活率来评价捕食菌的细菌间竞争能力。结果表明,hcp1、hcp2、hcp3全部缺失的菌株,W3110存活率上升最显著;在3株单缺失菌株中,相对于亲本菌株,hcp2缺失后,W3110的存活率显著上升;hcp1、hcp3缺失后,W3110的存活率略微有上升,但并不显著。推测在细菌间竞争过程中,hcp2发挥主要功能,hcp1、hcp3发挥辅助协同作用。4.猪源肠外致病性大肠杆菌hcp家族基因缺失株及亲本株致病性研究将缺失株与亲本株于37℃,5%CO2条件下进行细胞吞噬后存活试验及粘附侵入试验。利用猪肺泡巨噬细胞(PAM)进行的吞噬后存活试验表明,hcp家族基因缺失后,吞噬后的存活能力均下降,其中hcp1缺失后下降显著,三基因缺失株下降最明显。推测在吞噬后存活过程中,hcp1和hcp3发挥主要功能,hcp2发挥辅助协同作用。利用猪肾细胞(PK-15)进行的粘附侵入试验表明,hcp家族基因缺失后对粘附能力均无显著影响,hcp1、hcp2缺失后对侵入过程均有影响但不显著,只有三基因缺失株下降显著。推测hcp家族基因主要影响菌株的侵入能力而非粘附能力。将缺失株与亲本株腹腔分别以107、106、105CFU的剂量接种于4周龄昆明小鼠,记录小鼠死亡率。结果显示,相对于亲本株hcp家族基因缺失后,昆明小鼠死亡情况并无明显改变。将缺失株与亲本株分别以107CFU的剂量经尾静脉接种7周龄C57/BL3小鼠,对血液中的菌量及脑、肾、脾的载菌量进行计数比较,结果显示,hcp家族基因缺失后,在血液中的菌量和在组织中的载菌量均显著下降,且三基因缺失株下降幅度最大。推测hcp家族基因与菌体在机体内存活与定植相关,且3个hcp基因之间存在协同作用。