弓形虫病由弓形虫而引起,该虫体可寄生于人类及多数温血动物,引起人兽共患弓形虫病。人类免疫力正常时其感染通常没有症状,但对免疫缺陷者可引起致死性损害,属最常见的机会致病原虫。孕妇感染弓形虫后,虫体多数能传给胎儿造成先天性损害。在畜牧业,弓形虫能引起动物疾病及胚胎流产而造成严重的经济损失和影响畜牧业发展。该虫生活史复杂,存在着众多的感染途径。目前已知虫体能经口传播,通常因生食、或半生食动物肉类或饮水而感染。孕妇感染弓形虫后虫体由胎盘传给胎儿。能经输血而传播;也存在着经伤口接触虫体而导致感染的可能性。还有报导因猫咬伤而感染弓形虫。近年来发现,弓形虫病的分布有以下特点:欧美地区感染率高,而欠发达地区其感染率低。在我国弓形虫感染率有逐年增高的趋势,1985～1996年国内平均感染率为4.9%。2004年的国内弓形虫感染率为7.88%。感染率升高的原因与国内居民饮食习惯,接触猫科动物等因素有关系。但是否与社会性观念的改变及婚外性行为的增加有关尚不得而知。弓形虫寄生在宿主除红细胞以外的所有有核细胞内,常见的受损器官有脑、眼、心、肝、肺、肾等。在睾丸组织和精液中已发现虫体的存在。而且在女性阴道分泌物内已检测到虫体DNA的存在。弓形虫能否经性行为传播及雌性阴道状态对精液传播弓形虫的影响是一个至今尚未深入探讨的话题。多年来,由于弓形虫虫体的微小及在宿主体内常以隐性感染状态出现,因此弓形虫的感染检测常靠免疫学手段进行;检测方式均为定性检测。而其病原学检测常采用小鼠腹腔接种的方式。因此,对弓形虫虫体本身在宿主体内的动态变化未能进行研究。1996年荧光定量PCR技术的出现及2000年在弓形虫检测上的应用为研究带来希望。因此本文以RH株弓形虫为虫株,以家兔为实验动物建立雄性弓形虫感染模型和雌兔不同阴道健康状态模型。采用普通PCR和荧光定量PCR技术对雄性家兔血液、精液中虫体进行了动态观察;通过弓形虫抗体和DNA的检测,观察了不同阴道健康状态的雌兔在利用感染弓形虫的雄兔精液授精后雌兔的感染情况。一、家兔实验动物模型的建立建立雄性家兔弓形虫感染模型和雌性家兔不同阴道健康状态模型。用16只健康成年新西兰雄兔,每只经腹腔感染Rtt株弓形虫速殖子10万个,在感染前后耳缘静脉每周采集外周血,制备全血标本和血清标本;假阴道法采集精液标本。27只雌性成年健康家兔,体重3kg左右,随机分为4组。第一组,阴道正常组(7只雌兔);第二组,阴道损伤组(7只);第三组,阴道毛滴虫感染组(7组);第四组,白色念珠菌感染组(6只)。第一组雌性家兔为阴道健康状态组;第二组每天用消毒棉签插拭阴道,出血为止。第三组每天用培养的阴道毛滴虫虫体液滴加阴道内,直至阴道有淡黄色分泌物出现,且分泌物内显微镜下能查到滴虫虫体为止。第四组每天阴道内滴加培养的白色念珠菌菌液,直至阴道分泌物中查见菌体为止。结果发现:雄兔动物模型建立:经腹腔以每只10万虫体感染雄性家兔后,8只雄性家兔在感染后7～14天死亡。存活的8只雄性家兔感染前后每只、每周均能从耳缘采集到血液;但由于虫体的感染,在感染后7～14天因雄性动物不发情,采集不到精液标本。而其他周次雄性家兔均能采集到精液。雌兔动物模型:成功建立了四种不同阴道健康状态动物模型。结论表明:RH株虫体以1×105剂量感染家兔,死亡率在50%左右,精液标本采集较血液困难。利用雌性家兔能建立类似于人类阴道健康状况的模型。二、弓形虫感染动物免疫学检测方法的建立建立家兔血清中弓形虫IgG抗体检测的酶联免疫吸附试验(ELISA)。用纯化后的RH株弓形虫速殖子反复冻融、多次超声粉碎后超速离心,取上清制备虫体抗原,包被进口酶标反应板。用已知混合的弓形虫感染阳性血清倍比稀释后滴加酶标反应孔内,以辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体作为二抗,邻苯二胺为底物进行棋盘滴定以获得最佳的抗原包被浓度及血清稀释度。结果表明:最佳的抗原包被浓度为0.1 5ug/ml,血清最佳稀释度为1:80。结论表明:本次建立的家兔血清中抗体检测ELISA方法是成功的。三、弓形虫感染动物体液中虫体DNA的定性检测方法的建立评价国内公司研制的弓形虫PCR检测试剂盒,筛选出较好的检测方法用于家兔体液中虫体DNA检测。采用市售的国内生产的4种弓形虫PCR试剂盒检测弓形虫阳性兔的血液及精液标本。结果表明:温州伊利康TOX-PCR试剂盒、北京美迪科TOX-PCR试剂盒对家兔感染前后血液、精液标本均未出现阳性结果。上海复生TOX-PCR试剂盒检测家兔精液标本感染前阴性,感染后均能出现相应的结果,而检测血液标本杂带太多。洛阳华美TOX-PCR试剂盒检测家兔血液标本、精液感染前均为阴性,感染后血液标本阳性率76.53%,43份精液标本阳性率2.33%。结论表明:目前国内市售的TOX-PCR试剂盒可检测各种组织标本,但实际应用价值局限。复生试剂盒适合于家兔精液中弓形虫DNA的检测;华美公司试剂适合于血液中虫体DNA的检测。四、弓形虫感染动物体液中虫体DNA的定量检测方法的建立利用TaqMan探针法建立荧光定量PCR进行家兔血液、精液中虫体DNA的定量检测。用弓形虫虫体单拷贝热休克蛋白基因Hsp20(基因总长度片段为240bp,表达产生20kd的热休克蛋白),设计一对特异引物,其序列如下:F:5’-GCGACATGGACGAGATGCT-3’R:5’-CAGTTGGCCTTCGCCGACC-3’,建立荧光定量PCR技术。采用碱加热法提取精液中总DNA,碘化钠法提取血液中总DNA。采用美国应用生物系统公司QRT-PCR仪PE 7000进行PCR反应。结果表明:8份感染前的全血均阴性;感染后1～3周全血7份全部阳性。感染前雄兔精液6份检测均为阴性;感染后4～9周5份精液3份(3/5)能测定出一定虫体密度。结论表明:本次建立的荧光定量PCR技术敏感性和特异性能满足定量检测需要。五、弓形虫感染家兔血液、精液中虫体的动态研究观察弓形虫虫体在血液、精液中动态变化情况。对比普通PCR和FQ-PCR检测感染家兔血液中弓形虫基因动态检测结果。用RH株弓形虫速殖子105个/只的剂量腹腔感染雄性家兔16只。在家兔感染前后分别采集血液、精液,-40℃冻存备用。普通PCR连续检测血液标本中虫体DNA基因片段;用实时定量PCR(QRT-PCR)方法检测弓形虫感染家兔血液、精液中弓形虫DNA拷贝量,依据标准曲线计算出血液、精液中虫体密度,绘制感染后时间与血液、精液中虫体含量的动态曲线图。结果表明:FQ-PCR检测:感染前雄性家兔血液检测均为阴性,感染后血液总阳性率为64.42%。血液中虫体密度高峰期在感染后1wk左右,其密度最高值为2.48×105个/ml,其后长期维持在较低水平,感染后121d血液虫体密度达最低值为1.45×103个/ml。精液检测总阳性率为26.67%,最早在感染后7d能检测到虫体DNA,精液中虫体最大密度值为1.48×105个/ml,高峰期在感染后7wk左右,峰期过后,精液中虫体密度维持在平台期水平,至感染后第15wk,精液中仍有4.68×103个/ml虫体存在。普通PCR检测:感染家兔血液中虫体DNA检测总阳性率为45%,感染后第1wk检出率仅22%,高峰期维持在感染后2～4wk,检出率约为60%左右。其后检出率下降为25%左右并一直维持。用普通PCR检测感染雄兔精液,感染后8d有较强反应,感染72d仍有阳性反应出现。结论表明:两种PCR检测方法有相同的动态检出效果,采用血液作为样品进行弓形虫PCR检测时其最佳检测时间为感染后1～4wk,其后检出率逐渐下降。弓形虫感染雄兔其血液、精液中虫体含量动态变化不同。六、实验动物精液传播弓形虫的研究为了解弓形虫能否通过精液传播,并探讨雌兔阴道不同健康状态对精液传播弓形虫的影响。8只健康新西兰雄兔经腹腔分别感染1×105个RH株弓形虫速殖子,分别于感染前、后用假阴道采集雄兔精液,每周将采集到的精液混合液化后分别经宫腔内人工授精管感染4组(0.1 ml/只))阴道健康状态不同的成年新西兰雌兔(阴道正常组、阴道损伤组、滴虫性阴道炎组和霉菌性阴道炎组),共采集8周,将所得8份混合精液分别感染8次。每次授精后第2～3天耳缘静脉采血(2 ml),分别用ELISA和PCR检钡恤清抗弓形虫抗体和全血中弓形虫B1基因片段。ELISA结果显示,雌兔在初次受精后第16天可检测到抗弓形虫IgG抗体,第1～4组抗体阳性家兔数分别有2、1、3和1只,ELISA阳性率为25.9%(7/27)。PCR检测最早在授精后3d和最晚51d可扩增出弓形虫B1基因片段200bp,第1～4组阳性家兔数分别有2、1、2和0只,PCR阳性率为18.5%(5/27)。其中两种检测结果均为阳性的有3只。结论弓形虫可通过精液感染雌兔。雌兔的阴道健康状态对经精液感染弓形虫无影响。本项研究得出如下结论:用1×105个/只RH株弓形虫速殖子感染16只雄性家兔时,有8只在感染后的7～14d死亡。用27只雌性家兔,成功建立了4种不同阴道健康状态模型。用建立的普通PCR和荧光定量PCR进行血液中虫体DNA检测时发现,其最佳检测时间为感染后1～4周,其后检出率下降。利用荧光定量PCR连续检测家兔血液和精液中虫体时发现:血液中虫体密度高峰期在感染后1周左右;精液中虫体密度高峰期在感染后7周左右。血液和精液中虫体密度有着不同的动态变化。利用感染家兔精液对27只雌兔进行人工受精时,采用ELISA和PCR对受精雌兔进行弓形虫感染的检测时发现:雌兔经精液传播的概率为11.1%,雌兔阴道健康状态对精液弓形虫的传播影响不大。