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丹参(Salvia miltiorrhizaBunge),唇形科多年生药用植物,其根部是我国传统大宗药材,在治疗心脑血管疾病、组织损伤、血脂升高等方面具有很好的疗效,被誉为“药用模式植物”。现代药理学研究证实,丹参的主要药用成分可分为以酚酸类为代表的水溶性化合物和以丹参酮类为主的脂溶性物质。miR156是一类进化非常保守的非编码小RNA,是植物中目前已知的唯一年龄因子。已有研究表明,miR156不仅调控植物的生长发育(包括生殖转型、形态建成、雌配子发育、表皮毛发育、侧根生长、开花时间、生物量),同时也影响植物抗性以及次生代谢产物的积累。本论文以“药用模式植物”丹参为主要研究对象,从中克隆得到miR156前体序列—Sm-MIR156a,通过对Sm-MIR156a进行过表达和干涉研究,探究miR156对丹参生长及次生代谢含量的影响。主要研究内容及结果如下:1、基于保守的成熟Sm-miR156序列,从丹参基因组Survey数据库中搜索并克隆得到长度为465bp的丹参miR156前体序列—Sm-MIR156a;生物信息学分析发现,Sm-MIR156a的可形成稳定的二级茎环结构;以不同植物miR156前体序列构建系统进化树,发现Sm-MIR156a进化非常保守,与其他物种中的MIR156a相似度非常高;荧光定量PCR结果显示:Sm-MIR156a在丹参不同组织部位均有表达;随着从营养期转到生殖期其表达量逐渐在减少。2、利用artificial microRNAs(amiRNAs)介导基因沉默的原理,成功构建Sm-MIR156a干涉载体,通过农杆菌介导法转化丹参。实时定量PCR检测不同干涉株系中Sm-MIR156a的表达量,干涉株系A、B、E、K中Sm-MIR156a的表达量分别是对照的43%、27%、35%、37%;15条预测的miR156靶标基因SmSPLs在转基因干涉株系中的表达水平与对照相比均显著上调,推测15条SmSPLs可能是miR156的靶标。Sm-MIR156a被干涉的转基因株系鲜重、叶绿素含量与对照相比均显著降低。3、对Sm-MIR156a干涉转基因株系和对照株系中次生代谢产物含量进行比较分析,结果显示:转基因株系(B和E)根中总酚、总黄酮的含量相比于对照均有显著的提高,地上部分总酚酸含量显著高于对照,但总黄酮含量显著低于对照;运用HPLC检测干涉株系和对照株系中迷迭香酸、丹酚酸B、丹参酮I、和隐丹参酮等主要成分的积累量,结果发现,干涉Sm-MIR156a不仅影响丹参酚酸类物质含量,同时也影响丹参酮类物质含量的积累,与对照相比,干涉株系B、E中丹酚酸B、迷迭香酸、丹参酮I和隐丹参酮的含量均有明显的提高。4、实时荧光定量PCR检测干涉株系中丹酚酸类物质及类黄酮等通路上关键酶基因的变化,结果发现,干涉株系E中TAT1、HPPR1、PAL2、C4H1、4CL2表达量分别是对照的20.5、5.9、1.8、13.5、8.4倍;类黄酮途径中ANS、CYP98A14、F3’H、F3’5’H、FLS、DFR的表达量分别是对照的 3.8、2.7、6.6、28.9、47.6、8.3倍;与木质素合成相关的酶基因CCR和COMT的表达量分别是对照的25.7和4.2倍。说明miR156对丹参酚酸类、类黄酮及木质素代谢通路上的基因均有调控作用。5、成功构建Sm-MIR156a过表达载体,通过农杆菌浸染法转化烟草,筛选得到一系列Sm-MIR156a过表达的转基因株系。通过观察转基因烟草表型,发现Sm-MIR156a过表达的转基因烟草分枝明显增多,叶片数量显著增加,但叶面积较小、较幼嫩,转基因烟草鲜重明显增加;实时荧光定量PCR检测结果表明,在烟草中异源过表达Sm-MIR156a后,检测烟草中已被证实的miR156的4个靶标NbSPL4、NbSPL5a、NbSPL5b、NbSPL9的表达量均显著下调,分别是对照的20%、40%、37%、16%;OE-1株系中与独脚金内酯合成相关的3个酶基因CCD7、CCD8、BCR1的表达量分别是对照的25%、49%、67%;HPLC方法检测转基因株系OE-1及对照株系次生代谢产物的变化,在烟草中异源过表达Sm-MIR156a后,烟碱、咖啡酸和莨菪葶的含量分别是对照的47%、30%、28%。综上所述,丹参miR156在丹参生长和次生代谢调控方面发挥着重要作用,本研究结果为利用植物基因工程选育丹参优良品种奠定了一定的基础。