肌萎缩侧索硬化症（Amyotrophic lateral sclerosis,ALS）是一种以脑干、脊髓和运动皮层中运动神经元（motor neuron,MN）大量死亡为特征的致死性神经退行性疾病。ALS可分为两种类型:散发型肌萎缩侧索硬化症（SALS）和家族型肌萎缩侧索硬化症（FALS）。其中散发型病例大约占90%-95%。家族型病例大约占5%-10%。散发型肌萎缩侧索硬化症的发病原因没有明显的遗传因素。而患有家族型肌萎缩侧索硬化症的病人被发现有明显的家族遗传病史。尽管这两种疾病类型在遗传因素上有差异,但其临床表现及病理特点基本相同,最常见的临床表现为肌肉萎缩、瘫痪。ALS患者一般在发病后的3-5年内死于呼吸困难和吞咽困难。然而,目前尚无有效的ALS治疗方法。SALS的发病原因目前尚不明确。但经大量研究表明,约20%FALS的发病原因与Cu²⁺/Zn²⁺超氧化物歧化酶（mSOD1）的基因突变有关。故转基因mSOD1小鼠模型被用作ALS研究的工具鼠。在人类ALS和转基因mSOD1小鼠模型中,神经炎症和自噬在ALS的发病机制中起重要作用。其中,神经炎症的病理表现主要在于广泛的小胶质细胞激活、星形胶质细胞增生及外周免疫细胞的浸润。有研究表明,Fractalkine（FKN;CX3CL1）,是趋化因子CX3C亚家族的唯一成员,几乎只在神经元细胞上表达。其受体CX3CR1主要表达在小胶质细胞上。CX3CL1与CX3CR1的相互作用主要在于调节小胶质细胞的活性。在正常生理状态下,神经元周围存在大量小胶质细胞突起,当发生神经元损伤时,小胶质细胞迅速做出反应以保护神经元免受损伤或清除已受损神经元。CX3CL1/CX3CR1信号通路就参与了此过程。在阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）小鼠模型中,敲除CX3CR1,可以观察到神经元丢失减少,小胶质细胞吞噬活性增加,异常聚集的淀粉样蛋白减少。在变态反应性脑脊髓炎（allergic encephalomyelitis,EAE）的小鼠模型,敲除CX3CR1,可以观察到小脑中神经脱髓鞘增加,轴索损伤加重,神经元数量减少。在不同动物模型中,CX3CR1所起到的作用截然相反,这引起了我们对CX3CR1的极大兴趣。经大量查阅资料文献,在ALS小鼠模型中,尚无对CX3CR1的机制研究。故在本试验中,我们将应用CX3CR1基因敲除小鼠,以研究CX3CL1/CX3CR1通路在ALS疾病中的作用及相关机制,以期待可以找到一种新的治疗靶点来调节小胶质细胞的活化并减缓ALS的疾病进展,提高患者生活质量。第一部分ALS小鼠模型中CX3CR1、CX3CL1及炎症、自噬相关指标的变化目的:我们分别选取发病前期、发病期及终末期的G93A-SOD1转基因小鼠（雄性）腰髓组织,观察不同时期CX3CR1、CX3CL1及炎症、自噬相关蛋白的表达变化。方法:我们选取从Jackson实验室（美国密西西比州巴尔港）获得携带含有氨基酸取代Gly93→Ala的突变人SOD1基因的G93A-SOD1转基因小鼠作为动物模型。从小鼠尾部组织中提取出DNA,应用PCR方法对小鼠进行鉴定。选取G93A-SOD1转基因阳性小鼠为受试对象。选取发病前期、发病期及终末期三个时间点进行观察。每个时间点分别取3-5只小鼠。我们新鲜取材,提取腰髓组织蛋白,通过蛋白印迹法分析研究CX3CR1、CX3CL1、SOD1及炎症、自噬相关蛋白的表达变化。结果:1.所有纳入实验的阳性G93A-SOD1转基因雄性小鼠均经PCR方法鉴定核实。2.不同时期取材的蛋白印迹法结果显示终末期CX3CR1蛋白表达量较发病前期明显增加。CX3CL1蛋白表达量随时间变化逐渐减少。终末期NEUN较发病前期明显减少,CD11b、SOD1较发病前期明显增加。3.不同时期炎症因子相关蛋白显示:IL-1β、INOS在终末期明显增多。ARGINASE-1、TGF-β在终末期明显减少。4.随着ALS疾病的进展,自噬通路受损,突变SOD1蛋白异常集聚增加。第二部分敲除CX3CR1基因对ALS小鼠模型生存期、发病期及行为学影响目的:通过上述实验,我们观察到CX3CR1、CX3CL1蛋白表达量随时间出现不同的变化,所以我们考虑其可能参与到ALS的疾病进展中。故我们选用CX3CR1基因敲除小鼠,观察其体重、生存期、发病期及行为学的变化。方法:G93A-SOD1转基因雄性小鼠与CX3CR1^-/-雌性小鼠合笼,其子代SOD1^G93A/CX3CR1^+/-雄性小鼠与不携带SOD1^G93A基因CX3CR1^+/-雌性小鼠合笼,得到SOD1^G93A/CX3CR1^-/-,SOD1^G93A/CX3CR1^+/+小鼠模型用于实验观察。从小鼠尾部组织中提取出DNA,应用PCR方法对小鼠进行鉴定。在整个观察过程中,小鼠被安置在12:12h的光/暗循环下,温度和湿度受控。食物和水一周给两次,以确保小鼠在任何时候都有足够的食物和水供。结果:1.使用Kaplan-Meier分析,雄性SOD1^G93A/CX3CR1^-/-小鼠生存期较雄性SOD1^G93A/CX3CR1^+/+小鼠明显缩短（log rank P=0.003）。雌性SOD1^G93A/CX3CR1^-/-小鼠生存期较雌性SOD1^G93A/CX3CR1^+/+小鼠生存期未见明显差异（log rank P=0.2074）;2.体重、发病期在CX3CR1基因敲除小鼠与未敲除小鼠之间未见明显差异;3.110天龄SOD1^G93A/CX3CR1^+/+小鼠后肢外展灵活有力,步态正常,有攀爬动作,对应相同时间点SOD1^G93A/CX3CR1^-/-小鼠双后肢无自主外展动作,行走时后肢无力。足迹测试SOD1^G93A/CX3CR1^+/+小鼠与SOD1^G93A/CX3CR1^-/-小鼠相比步幅大,足迹清晰有力。步幅统计分析P<0.01,具有明显统计学差异。第三部分敲除CX3CR1基因对ALS小鼠模型小胶质细胞及炎症因子的影响及机制研究目的:我们观察到CX3CR1基因敲除ALS小鼠生存期较ALS小鼠明显缩短,CX3CR1基因参与ALS疾病的进展。又因CX3CR1主要表达于小胶质细胞上。所以我们进一步观察CX3CR1基因敲除ALS小鼠模型中小胶质细胞及炎症因子的变化并对相关机制进行研究。方法:我们选取终末期和发病前期雄性SOD1^G93A/CX3CR1^+/+小鼠和SOD1^G93A/CX3CR1^-/-小鼠作为动物模型。从小鼠尾部组织中提取出DNA,应用PCR方法对小鼠进行鉴定。选取SOD1^G93A/CX3CR1^+/+小鼠和SOD1^G93A/CX3CR1^-/-小鼠,用致死剂量的水合氯醛深麻醉,经心内灌注生理盐水,然后灌注4%多聚甲醛固定。我们从脊髓中分离出腰膨大并切片。用免疫荧光法染色观察Iba1、NEUN、PP65、IKB-α、IKK-β在腰髓组织切片表达分布变化特征。选取SOD1^G93A/CX3CR1^+/+小鼠和SOD1^G93A/CX3CR1^-/-小鼠,新鲜取材。通过蛋白印迹法分析IL-1β、INOS、ARGINASE-1、TGF-β、TNF-α、P65、PP65、IKB-α和IKK-β的表达变化。结果:1.腰髓组织切片免疫荧光法染色结果显示:Iba1在终末期SOD1G93A/CX3CR1^-/-小鼠中的表达数量及荧光强度明显增多及增强。NEUN在终末期SOD1^G93A/CX3CR1^-/-小鼠中的表达数量及荧光强度明显减少和减弱。蛋白印迹法结果显示:CD11b在终末期SOD1^G93A/CX3CR1^-/-小鼠中的表达量明显增多。NEUN在终末期SOD1^G93A/CX3CR1^-/-小鼠中的表达量明显减少;2.蛋白印迹法结果显示:IL-1β、INOS在终末期SOD1^G93A/CX3CR1^-/-小鼠中的表达量明显增多。ARGINASE-1、TGF-β在终末期SOD1^G93A/CX3CR1^-/-小鼠中的表达量明显减少。TNF-α在发病前期SOD1^G93A/CX3CR1^-/-小鼠中的表达量明显增多;3.腰髓组织切片免疫荧光法染色结果显示:PP65和IKK-β在终末期SOD1^G93A/CX3CR1^-/-小鼠中的表达数量及荧光强度明显增多及增强。IKB-α在终末期SOD1^G93A/CX3CR1^-/-小鼠中的表达数量及荧光强度明显减少和减弱。蛋白印迹法结果显示:PP65/totalP65和IKK-β在终末期SOD1^G93A/CX3CR1^-/-小鼠中的表达量明显增多。IKB-α在终末期SOD1^G93A/CX3CR1^-/-小鼠中的表达量明显减少。第四部分敲除CX3CR1基因对ALS小鼠模型中SOD1蛋白及自噬通路的影响目的:有研究表明,自噬能够抑制炎症信号蛋白复合体的形成。故这部分实验我们观察CX3CR1基因敲除ALS小鼠模型中SOD1蛋白的表达变化并对自噬相关机制进行研究。方法:我们选取终末期雄性SOD1^G93A/CX3CR1^+/+小鼠和SOD1^G93A/CX3CR1^-/-小鼠作为动物模型。从小鼠尾部组织中提取出DNA,应用PCR方法对小鼠进行鉴定。选取SOD1^G93A/CX3CR1^+/+小鼠和SOD1^G93A/CX3CR1^-/-小鼠,用致死剂量的水合氯醛深麻醉,经心内灌注生理盐水,然后灌注4%多聚甲醛固定。我们从脊髓中分离出腰膨大并切片。用免疫荧光法染色观察P62、SOD1在腰髓组织切片表达分布变化特征。选取SOD1^G93A/CX3CR1^+/+小鼠和SOD1^G93A/CX3CR1^-/-小鼠,新鲜取材。通过蛋白印迹法分析SOD1、TBK1、P-TBK1、OPTN、LC3和P62的表达变化。结果:1.腰髓组织切片免疫荧光法染色结果显示:P62、SOD1在终末期SOD1^G93A/CX3CR1^-/-小鼠中的表达数量及荧光强度明显增多及增强。腰髓切片免疫荧光双染色显示P62和SOD1共定位数量明显增多。蛋白印迹法结果显示:SOD1在终末期SOD1^G93A/CX3CR1^-/-小鼠中的表达量明显增多;2.蛋白印迹法结果显示:OPTN、P62在终末期SOD1^G93A/CX3CR1^-/-小鼠中的表达量明显增多。P-TBK1和LC3-II/LC3-I在终末期SOD1^G93A/CX3CR1^-/-小鼠中的表达量明显减少。结论:1.敲除CX3CR1基因后,NF-KB信号通路被激活,促炎细胞因子（IL-1β、TNF-α,和INOS）表达量上调。抗炎细胞因子（ARGINASE-1、TGF-β）表达量减少,炎症反应增强,神经元数量减少,损害作用加重。2.敲除CX3CR1基因后,自噬通路受损,突变SOD1蛋白异常集聚增加,使经典活化小胶质细胞（Classically activated microglia,M1）数量增多,损伤作用增加。选择性激活小胶质细胞（alternatively activated microglia,M2）数量减少,保护作用减弱。3.上述结果的综合作用,使SOD1^G93A/CX3CR1^-/-小鼠生存期明显缩短。疾病进程加快,运动能力下降。