糖尿病肾病(Diabetic kidney disease,DKD 或 Diabetic nephropathy,DN),是由糖尿病导致的慢性肾脏病,在发达国家,DN已经成为终末期肾病的主要原因。DN发病机制复杂,长链非编码RNA与自噬在发病机制中的作用被越来越多的认识到。因机制的不明确性,目前尚缺乏有效的治疗方案,益肾颗粒(Yishen Granule,YSG)是导师张宁教授治疗DN的经验方,临床已验证其有效性,并成为院内制剂,但是YSG的药理成分和作用机制尚不清楚。所以,本研究以高糖高脂饲料喂养联合STZ腹腔注射构建的DN大鼠模型和糖脂毒诱导的足细胞损伤模型为研究对象,予益肾颗粒进行干预,观察YSG通过LncRNA MALAT1/mTOR信号通路,激活足细胞自噬,减轻病理损伤,延缓DN进展的作用和机制。并且,通过高效液相色谱分析法鉴定YSG的化合物成分。实验一:益肾颗粒成分鉴定目的:通过高效液相色谱分析法鉴定YSG的化学成分,明确YSG发挥作用的物质基础。方法:水提法对益肾颗粒进行预处理,减压浓缩后进行定容,所得滤液过0.45μm的微孔膜,取10ul注入高效液相色谱仪。同时,制备标准品溶液,过0.45μm的微孔膜,取10ul,注入高效液相色谱仪。优化高效液相色谱分析仪检测条件:ODS色谱柱,流动相:乙腈(A)-水(B)梯度洗脱:0-10min 2-10%A,10-20min 10-20%A,20-30min 20-30%A,30-40min 30-60%A,40-50min 60-80%A,50-60min 80-95%A,60-65min 95%A;流速 1ml/min,柱温 30℃,进样量10ul(益肾颗粒/标准品),分离纯化得到化合物。将益肾颗粒的波峰与标准品波峰,进行比对,比对成功即为益肾颗粒成分。结果:在不同的波长254nm和203nm中,可以分离出比较清晰的波峰,得到益肾颗粒的色谱图。与标准品比对后,在254nm波长时,毛蕊异黄酮葡萄糖苷、丹参酮ⅡA、丹参酮Ⅰ、隐丹参酮4个成分得到明确。在波长为203nm时,黄芪甲苷、藁本内酯、没食子酸、梓醇4个成分得到明确。结论:通过HPLC法鉴定益肾颗粒中8种成分,分别为黄芪甲苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、丹参酮ⅡA、丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、藁本内酯、没食子酸、梓醇,为YSG的作用和机制研究奠定物质基础。实验二:益肾颗粒防治HFSD+STZ诱导的糖尿病肾病模型大鼠肾小球硬化的作用。目的:观察YSG对纤连蛋白(FN)、平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、足细胞desmin蛋白的影响,探讨YSG防治DN肾小球硬化的作用。方法:采用高脂高糖饲料(high fat/high sucrose diet,HFSD)喂养配合STZ腹腔注射方法构建糖尿病肾病模型。HFSD喂养6周,然后予1%STZ溶液30mg/kg腹腔注射。72h后,3次尾静脉随机血糖≥16.7mmol/L,为糖尿病成模标准,即为本次研究的模型纳入标准。分为模型组、氯沙坦钾组、益肾颗粒低剂量组、益肾颗粒中剂量组、益肾颗粒高剂量组,另设正常组。分别予灌胃干预10周。干预结束后,麻醉杀检。双缩脲法检测24小时尿蛋白定量(24hU-Pro),酶法检测大鼠空腹血糖(FBG)、血浆白蛋白(ALB)、血肌酐(Scr)、尿素氮(Bun)、胆固醇(CHO)、甘油三酯(TG)等。肾组织进行HE、PAS病理染色,FN、α-SMA免疫组化,desmin免疫荧光,caspase-3免疫印迹。结果:与正常组相比,模型组24hU-Pro、Bun、FBG、CHO、TG均增加(P<0.01或P<0.05),ALB减少(P<0.01),益肾颗粒干预后,24hU-Pro、Bun、FBG、CHO、TG均有下降(P<0.01 或P<0.05),ALB增加(P<0.05)其中益肾颗粒高剂量效果最为明显,效果优于氯沙坦钾组。HE、PAS染色显示:模型组出现肾小球基底膜增厚、系膜基质的增多、肾小管内细胞空泡样变性、内皮细胞损伤;未出现K-W结节、肾小球塌陷、小动脉玻璃样变性等晚期病变;氯沙坦钾组、益肾颗粒组在用药10W后,肾组织均有不同程度的好转。α-SMA、FN免疫组化显示:正常组肾小球、小管及间质α-SMA、FN的阳性表达较少;模型组可见肾小球基底膜区、系膜区、肾小管上皮细胞、间质区等不同程度的阳性信号(棕黄染);氯沙坦钾、益肾颗粒干预后,阳性信号有不同程度减弱,以益肾颗粒高剂量组效果最为显著(P<0.01)。足细胞desmin免疫荧光、caspase-3免疫印迹结果显示:模型组desmin、caspase-3表达增加,益肾颗粒干预后,desmin、caspase-3表达下调(P<0.05)。结论:YSG可以降低DN模型大鼠的尿蛋白,减轻氮质血症,改善糖脂代谢,并且能够通过调节FN和α-SMA表达减轻病理损伤,最终延缓肾小球硬化进展。并且,益肾颗粒发挥这些作用,可能是通过减轻足细胞细胞骨架损伤,保护足细胞结构,减少凋亡产生的。实验三:益肾颗粒通过LncRNA MALAT1/mTOR信号通路调控自噬改善DN和足细胞损伤的机制研究。目的:观察益肾颗粒对足细胞LncRNAMALAT1和mTOR介导的自噬的影响,以及MALAT1-mTOR之间关系,探讨益肾颗粒作用机制。方法:体内实验部分:实验二中肾组织Atg5免疫组化;qRT-PCR检测MALAT1 表达;WB 检测 LC3、ATG5、SRSF1、p-mTOR、c-MYC 表达。体外实验部分:通过糖脂毒诱导足细胞损伤模型,25mM糖+0.08mM棕榈酸(PA)干预48h为造模条件,予益肾颗粒冻干粉进行干预,以氯沙坦钾为阳性对照。①通过CCK-8法检测足细胞增殖活力;划痕实验评估足细胞迁移能力;FITC鬼笔环肽进行细胞骨架染色;Lyso-tracker Red进行自噬溶酶体染色;Annexin V-FITC/PI流式细胞术进行足细胞凋亡检测;qRT-PCR检测MALAT1表达;WB检测足细胞骨架蛋白desmin、Synaptopodin;自噬相关蛋白ATG5、P62;通路相关蛋白p-mTOR、SRSF1、c-MYC表达。观察益肾颗粒对足细胞骨架、自噬、通路的作用。②加入自噬激活剂雷帕霉素(Rap)、抑制剂(CQ),WB法检测ATG5、P62表达水平,观察益肾颗粒对自噬的表达变化。在Rap条件下,qRT-PCR检测MALAT1表达,观察mTOR对MALAT1的作用,以及益肾颗粒在其中的作用。③对MALAT1进行siRNA干扰,qRT-PCR检测MALAT1表达,观察益肾颗粒对MALAT1的影响;WB检测p-mTOR、SRSF1、c-MYC表达,观察MALAT1对mTOR的作用,以及益肾颗粒在其中的作用。结果:体内实验部分:与正常组相比,模型组Atg5免疫组化表达减少,YSG干预后,Atg5表达增加。WB结果显示,模型组LC3、ATG5表达下调(P<0.05),p-mTOR表达上调(P<0.05),SRSF1、c-MYC 变化不明显;YSG干预后,自噬相关蛋白LC3、ATG5表达增加(P<0.05),p-mTOR表达下调(P<0.05)。提示YSG激活了自噬。体外实验部分:①益肾颗粒能够增加足细胞增殖活力,促进细胞迁移;与模型组相比,能增加Synaptopodin表达,减少desmin表达,使肌动蛋白束状排列整齐,减少细胞骨架重排。提示益肾颗粒能够增加足细胞活力,保护足细胞骨架。②益肾颗粒组与模型组相比,能够增加Atg5表达,减少P62累积;益肾颗粒+Rap组比Rap组、益肾颗粒+CQ组比CQ组Atg5表达更高(P<0.01),但P62未见减少。Annexin V-FITC/PI细胞凋亡显示,益肾颗粒干预后,凋亡率较模型组均明显下降,与正常组没有统计学差异(P>0.05)。提示,益肾颗粒能够增加足细胞自噬,增加自噬体形成和自噬溶酶体结合,减少足细胞凋亡。③益肾颗粒干预后,MALAT1表达较模型组增加(P<0.05),p-mTOR表达下调。沉默MALAT1后,p-mTOR增加,糖脂毒性损伤后,p-mTOR进一步增加(与阴性对照相比,P<0.05),益肾颗粒干预后,p-mTOR明显下调,与阴性对照相比没有统计学差异(P>0.05)。在糖脂毒条件下,与正常组相比,SRSF1表达减少,益肾颗粒和氯沙坦钾干预后,有表达增加趋势,但没有统计学差异(P>0.05);siRNA处理后,SRSF1表达增加,益肾颗粒干预后,比模型组表达增加趋势,但没有统计学差异(P>0.05)。c-myc在不同条件下,变化不大。提示,MALAT1与mTOR能够相互影响,呈负相关。YSG可以激活MALAT1/mTOR信号通路,机制可能与SRSF1剪接因子的调控作用关系不大。结论:MALAT1与mTOR能够相互影响,呈负相关。MALAT1的下调可以激活mTOR,进而抑制自噬,增加细胞凋亡。YSG可以通过激活MALAT1/mTOR信号通路,增加自噬(促进自噬体形成和自噬溶酶体结合),减少足细胞骨架重排,减少细胞凋亡。MALAT1对mTOR的调控作用,可能与SRSF1剪接因子的调控作用关系不大。