前言：　　胰腺癌是恶性程度最高的消化道恶性肿瘤之一，疾病进展快，预后差，易复发，中位生存期短，5年生存率不超过5％，是全球第八位肿瘤相关死亡原因，又被称为“癌中之王”[1,2]。目前胰腺癌侵袭转移调控的分子机制尚未完全明确，因此，研究胰腺癌细胞侵袭转移的分子机制可能为开发治疗胰腺癌的新型分子靶向治疗药物提供重要的实验依据，从而改善胰腺癌的术后生存期和预后。　　在前期研究中，利用BOP诱导叙利亚仓鼠实验性胰腺癌模型，建立了非解离型低转移株胰腺癌细胞系(PC-1)，再将PC-1细胞经尾静脉种植仓鼠体内，取转移癌建立了解离型高转移株胰腺癌细胞系(PC-1.0)。研究发现这两种同源细胞具有明显不同的增殖和运动能力。另外，我们近期对MAPK信号转导通路的研究证实MEK1和MEK2基因密切参与调控胰腺癌细胞增值凋亡和侵袭转移的调控[3-5]。　　现有研究发现microRNA(miRNA)参与调控细胞的增殖、代谢和凋亡，组织和神经的发育，血管的发生以及肿瘤的发生发展和转移等多种生理和病理过程。尽管miRNA参与了大部分细胞基因表达的调节，但在肿瘤组织和正常组织中的表达却存在明显差异[6，7]。部分miRNA在肿瘤组织中低表达，提示这些miRNA在肿瘤中可能发挥着抑癌基因的作用;相对的，还有一些miRNA在肿瘤组织中高表达，提示它们在肿瘤中可能发挥着致癌基因的作用[8]。最近又有研究发现人体组织中miRNA的表达谱可用于癌症的诊断以及预测癌症的预后等[9]。MicroRNA的差异表达与肿瘤发生发展和侵袭转移的关系及其潜在的诊断和治疗价值已经成为当前的一个研究热点。　　在前期研究中我们利用miRNAmicroarray方法，筛选出包括miRNA-222（以下简称miR-222）在内的解离型高转移株PC-1.0细胞系与非解离型低转移株PC-1细胞系的差异miRNAs，其中在PC-1.0细胞中表达上调miRNAs14个，表达下调miRNAs7个。miR-222在解离型高转移胰腺癌细胞株PC-1.0中表达下调，而在非解离型低转移胰腺癌细胞株PC-1中表达上调。　　丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activatedproteinkinase，MAKP)信号转导通路几乎存在于所有真核生物细胞中，为三级激酶体系:MAPK，丝裂原活化蛋白激酶激酶(MAPkinasekinase，MKK或MEK)和丝裂原活化蛋白激酶激酶激酶(MAPkinasekinasekinase，MAPKKK)。MEK1和MEK2是MEK家族的重要成员，作为MAPK信号转导通路中的重要激酶分子，参与了多数细胞的生理和病理学进程，包括细胞增殖、分化、应激、凋亡、侵袭和转移等。miR-222在胰腺癌细胞侵袭转移调控中的作用及其与信号转导通路的相互关系尚未见文献报道。　　目的：　　在本研究中拟利用Realtime-PCR、细胞转染及miRNA功能解析方法检测miR-222在不同的胰腺癌细胞中的表达并探讨miR-222参与调控胰腺癌细胞侵袭转移的分子机制。　　材料与方法：　　一、材料　　采用仓鼠非解离型低转移株胰腺癌细胞系PC-1及人胰腺癌Capan-2细胞系和仓鼠解离型高转移株胰腺癌细胞系PC-1.0及人胰腺癌Aspc-1细胞系。PC-1细胞系是利用BOP诱导的叙利亚仓鼠实验性胰腺癌模型建立。PC-1.0细胞系是由同系仓鼠尾静脉种植PC-1细胞后产生的肿瘤而建立。上述两种细胞系呈不同形态学方式生长。PC-1细胞呈岛样细胞克隆方式生长，PC-1.0细胞主要呈单个细胞方式生长。Aspc-1细胞系在形态学方面类似PC-1.0细胞系，而Capan-2细胞系则类似PC-1细胞系。本实验还用到前期研究中建立的PC-1.0MEK1基因敲减和PC-1.0MEK2基因敲减细胞株。　　本实验中应用的miR-222抑制剂(inhibitor)和类似物(mimics)均由Lifetechonology公司设计合成，miR-222探针及内参U6由Lifetechonology公司设计合成，载体RNAiMAX购自Lifetechonology公司。miRNA提取试剂盒购自Lifetechonology公司。　　二、方法　　通过Realtime-PCR验证miR-222在不同胰腺癌细胞中的表达差异。对解离型高转移胰腺癌细胞瞬时转染miR-222mimics，对非解离型低转移胰腺癌细胞瞬时转染miR-222inhibitor，并通过观察细胞形态、WoundHealing细胞迁移实验、CCK-8细胞增殖实验、PI细胞周期实验、Transwell侵袭实验等探讨miR-222在胰腺癌细胞中的作用。　　实验结果：　　一、验证miR-222在解离型高转移株胰腺癌细胞和非解离型低转移株胰腺癌细胞中的差异表达　　为验证前期研究miRNAmicroarray的实验结果，本实验利用Realtime-PCR进一步验证在仓鼠解离型高转移胰腺癌细胞(PC-1.0)和仓鼠非解离型低转移胰腺癌细胞（PC-1）中miR-222的差异表达，并与在人胰腺癌细胞Aspc-1和Capan-2中miR-222的差异表达作对比。结果证实miR-222在PC-1.0和PC-1细胞中的差异表达与前期mIRNAmicroarray的结果一致，PC-1.0细胞中miR-222的表达较PC-1细胞下调(P＜0.05)。在与上述细胞性状相似的人胰腺癌细胞Aspc-1和Capan-2中，miR-222表达同样为在Aspc-1中较Capan-2中表达下调(P＜0.05)。　　二、解离型高转移胰腺癌细胞和非解离型低转移胰腺癌细胞中分别瞬时转染miR-222inhibitor及mimics并检测转染效率　　分别对各细胞株进行瞬时转染miR-222inhibitor和mimics24小时后，用Realtime-PCR检测其转染效率。PC-1细胞中miR-222表达抑制率为83.9％(P＜0.05)，Capan-2细胞中抑制率为97.1％(P＜0.05);PC-1.0细胞中miR-222表达增强587％(P＜0.05)，Aspc-1细胞中miR-222表达增强8781％(P＜0.05)。　　三、miR-222的生物学功能解析　　1、非解离型低转移胰腺癌细胞转染miR-222inhibitor（抑制实验）　　瞬时转染miR-222inhibitor后明显增强了仓鼠非解离型低转移胰腺癌侵袭转移能力，并且在细胞形态学上有所改变，然而在增殖和细胞周期方面作用不显著。在人胰腺癌细胞株Capan-2中各方面作用均不显著。　　2、解离型高转移胰腺癌细胞转染miR-222mimics（激动实验）　　瞬时转染miR-222mimics后仓鼠解离型高转移胰腺癌细胞系PC-1.0和人胰腺癌细胞系Aspc-1的侵袭转移能力明显减弱，然而在增殖和细胞周期方面作用不显著。　　四、miR-222与MAPK信号转导通路的关系　　利用前期研究中建立的PC-1.0MEK1基因敲减胰腺癌细胞株和PC-1.0MEK2基因敲减胰腺癌细胞株，通过Realtime-PCR检测miR-222的表达变化，结果显示PC-1.0MEK1和MEK2基因敲减胰腺癌细胞中miR-222的表达较对照细胞均明显下调（P＜0.05），其中在PC-1.0MEK2基因敲减胰腺癌细胞中下调更为明显。　　结论：　　1、miR-222在解离型高转移株胰腺癌细胞和非解离型低转移株胰腺癌细胞中的表达存在明显差异。　　2、miR-222参与调控胰腺癌细胞的侵袭转移。　　3、miR-222可能通过MAPK信号转导通路参与胰腺癌细胞侵袭转移的调控。