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异基因(异体、异种)皮肤移植后的排斥反应主要是由活化T细胞主导的急性细胞性排斥反应,此过程中T细胞共刺激信号的参与对于T细胞活化和免疫排斥的发生是必需的,阻断共刺激信号,可导致T细胞无反应、细胞凋亡或克隆丢失,从而诱导免疫耐受。在已发现的多种T细胞共刺激信号中,公认最为重要的是B7-CD28信号和CD40-CD40L信号。利用蛋白或抗体可有效对其阻断,诱导免疫耐受,但存在制备复杂、成本较高、半衰期短和需要长期施用等弊端。腺病毒载体安全性高、制备容易以其介导基因治疗的方式将共刺激分子基因导入靶细胞中,使治疗性蛋白在特定区域表达,阻断共刺激信号,有望降低成本、延长效应时间。皮肤成纤维细胞易获取、培养及大量扩增,也是常用的组织工程皮肤种子细胞和皮肤基因治疗理想的靶细胞。因此本研究以体外培养的人皮肤成纤维细胞为靶细胞,用腺病毒介导CTLA4Ig和CD40Ig基因转染阻断公认最为重要的B7/CD28和CD40/CD40L信号,通过对Adv-CTLA4Ig、Adv-CD40Ig感染人皮肤成纤维细胞的效率检测、感染后细胞形态和增殖能力检测、目的蛋白表达检测及对其免疫性能影响检测,研究、评价腺病毒基因治疗方式介导CTLA4Ig和CD40Ig阻断双共刺激信号应用于人皮肤成纤维细胞修饰和治疗的效果和可行性,为其应用提供基础资料。其主要内容如下:1.采用流式细胞分析技术检测腺病毒对体外培养人皮肤成纤维细胞的转染效率。结果表明:Adv-EGFP在感染复数(MOI)为50,100时对人皮肤成纤维细胞转染效率约为51.7±7.24%、69.99±3.26%,同时对细胞形态和增殖能力无明显影响。因此本研究选用100为腺病毒感染人皮肤成纤维细胞的MOI。2.采用形态学观察和MTT法细胞活力检测重组腺病毒转染对体外培养人皮肤成纤维细胞生长形态和增殖能力的影响。结果表明:重组病毒Adv-CTLA4Ig、Adv-CD40Ig在MOI为100时单独和混合转染人皮肤成纤维细胞后,实验组与对照组细胞形态均呈长梭形、不规则三角形,平行、放射状或漩涡状分布,有较长胞质突起,轮廓清晰,并且各组细胞增殖能力无显著差异(P＞0.05)。3.采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测重组腺病毒介导CTLA4Ig和CD40Ig在体外培养人皮肤成纤维细胞培养上清中的表达情况。结果显示:重组病毒Adv-CTLA4Ig、Adv-CD40Ig在MOI为100单独和混合转染人皮肤成纤维细胞后,在培养上清中均检测到相应目的蛋白的表达,其表达量分别是:Adv-CTLA4Ig转染组:CTLA4Ig 2.79±0.08ug/ml;Adv-CD40Ig转染组:CD40Ig 1.25±0.11ug/ml;Adv-CTLA4Ig+Adv-CD40Ig转染组:CTLA4Ig2.14±0.21ug/ml,CD40Ig 1.00±0.04ug/ml。4.采用重组腺病毒Adv-CTLA4Ig、Adv-CD40Ig转染后的体外培养人皮肤成纤维细胞与人外周血单个核细胞混合培养检测对人皮肤成纤维细胞免疫性能的影响。结果显示:重组病毒Adv-CTLA4Ig、Adv-CD40Ig以MOI为100单独和混合转染的体外培养人皮肤成纤维细胞对人外周血单个核细胞增殖抑制均优于对照组,有显著性差异(单处理组P＜0.05,混合组P＜0.01),Adv-CTLA4Ig和Adv-CD40Ig混合处理组抑制效果优于各单处理组(P＜0.05)达到31.67±2.25%,Adv-CTLA4Ig处理组(23.41±1.23%)优于Adv-CD40Ig(19.83±4.71%)(P＜0.05)。综上所述,重组腺病毒Adv-CTLA4Ig、Adv-CD40Ig可以有效转染体外培养人皮肤成纤维细胞;介导CTLA4Ig和CD40Ig表达;对细胞生长形态和增殖能力无明显影响;通过腺病毒介导方式能有效阻断B7/CD28、CD40/CD40L共刺激信号,抑制体外培养人外周血单个核细胞增殖,阻断B7/CD28信号诱导抑制效果优于CD40/CD40L信号,阻断双信号可更大程度诱导免疫抑制,因共刺激信号多样、免疫反应复杂性及施用量、处理时间的原因,并不能完全抑制。结论:腺病毒基因治疗方式介导CTLA4Ig和CD40Ig阻断B7/CD28、CD40/CD40L共刺激信号可应用于人皮肤成纤维细胞修饰和治疗。