山羊(Capra hircus)是重要的经济动物之一,为人类提供毛、肉、皮等优质的农产品,然而山羊繁殖力相对较低已成为制约山羊业快速发展的主要因素之一,所以人们一直致力于探索提高山羊繁殖力的育种新方法。卵巢是动物体内重要的生殖器官之一,在生殖调控过程中发挥非常重要的作用。microRNA(miRNA)是一类重要的非编码小RNA分子,其通过对靶基因转录后的调控实现对卵巢功能的调节进而影响机体生殖活动。然而山羊卵巢miRNA研究相对滞后,而山羊卵巢miRNA的鉴定与功能研究将推动生殖调控分子机制及山羊分子育种的研究。　　为进一步揭示miRNA在山羊卵巢功能发挥及生殖调控过程中的作用,阐明生殖内分泌遗传调控机制,找到可用于山羊标记辅助育种的分子标记,本课题进行了山羊卵巢miRNA的鉴定及生物学功能研究:(1)进行了妊娠和非妊娠山羊卵巢小RNA高通量测序,揭示了卵巢小RNA分布及序列特征,从而为miRNA转录组及差异分析提供了数据;(2)分析了妊娠和非妊娠山羊卵巢miRNA转录组特征,得到较为完整的miRNA表达谱及基因组信息,为功能和比较基因组学研究提供参考;(3)探明了妊娠和非妊娠山羊卵巢miRNA差异表达情况;(4)筛选了最优的内参基因,为目的基因的山羊组织表达相对定量分析提供了依据;(5)q-PCR验证了测序结果,并在山羊卵巢和其他组织中检测了目标miRNA的表达谱;(6)对卵巢中高表达的miRNA进行了靶基因预测和GO、Pathway功能分析,探讨了目标miRNA可能行使的生物学功能。　　以上研究主要获得如下结果:　　(1)对妊娠和非妊娠山羊卵巢小RNA文库进行高通量测序,分别获得9,977,224和11,209,532条的序列总数,质量处理后分别得到9,231,324和11,010,206条纯净序列,分别对应377,973和204,342种不同的纯净序列;大部分序列长度位于20~24nt之间,其中长度为22nt(典型miRNA序列长度)的序列所占比例最大,在妊娠和非妊娠文库中分别占到42.54％、56.13%,说明测序结果富含潜在miRNA。　　(2)构建绵羊、猪、牛、马和狗的已知miRNA数据库、绵羊参考基因组数据库、山羊无冗余EST数据库,通过同源比对等生物信息学方法,得到了较完整的山羊卵巢miRNA表达谱及转录组特征信息:　　妊娠和非妊娠文库分别获得535个和508个物种间保守的已知miRNA,共对应617种miRNA,其中包含85个绵羊已知的miRNA;各文库miRNA的表达主要集中在表达量前20位的miRNA上(均占所有miRNA总表达量的80%以上),其中miR-143在妊娠山羊卵巢中表达量最高,let-7b在非妊娠山羊卵巢中表达量最高。　　预测得到7个新的山羊miRNA。　　得到两文库中表达量前10位的miRNA在绵羊染色体上的基因坐标,它们当中有些miRNA只有一个基因坐标,有些则有两个基因坐标,且得到4种miRNA两两组合为潜在的miRNA簇。序列分析结果表明,miRNA主要是以异构体(isomiR)的形式存在,且部分miRNA存在单碱基突变现象(mirSNP)。　　以上转录组特征分析结果为进一步研究miRNA在体内的调控模式及比较基因组学提供了参考。　　(3)对测序表达量进行标准化和差异比较,结果发现617个miRNA中有471个为两文库共表达,90个为妊娠山羊卵巢特异表达,56个为非妊娠山羊卵巢特异表达;294个在妊娠文库中上调,113个在妊娠文库中下调;其中,非妊娠文库中表达量前10位的miRNA在妊娠文库中均下调,而妊娠文库中表达量前10位的miRNA中,miR-143、miR-99a、miR-125b、miR-148a、miR-10b和miR-26a6个miRNA在非妊娠文库中下调,let-7a、let-7f、let-7c和let-7b4个miRNA在非妊娠文库中上调。　　(4)q-PCR分析了18S、TBP、HMBS、YWHAZ、ACTB、HPRT1、GAPDH和EEF1A2等8个候选内参基因在山羊心、肝、脾、肺、肾、胃、子宫、卵巢、小肠和肌肉等10种不同组织中的表达稳定性。结果表明,18S为一般情况下最优的内参基因,但若试验精度要求较高,则需选择18S和TBP二者组合或者18S、TBP和HMBS三者组合作为内参。　　(5)q-PCR验证了5个随机选择的miRNA在妊娠和非妊娠山羊卵巢中的表达量,且检测了目标miRNA在山羊9种组织中的表达谱。结果表明,q-PCR数据与测序数据基本一致,本次测序结果真实可靠,能够反映妊娠和非妊娠山羊卵巢miRNA转录组;另外,miR-143和let-7b在9种山羊组织均有表达,且在山羊繁殖器官中(卵巢、输卵管、子宫)表达量较高。　　(6)利用PicTar和TargetScan软件预测两文库表达量前10位miRNA的靶基因,并对靶基因进行GO和Pathway分析。结果表明,目标miRNA的靶基因在GnRH、Wnt、MAPK、TGF-beta、卵母细胞减数分裂等生殖相关的细胞信号通路中显著富集。此外,miR-143和let-7b的靶基因在细胞增殖与凋亡调节、核苷酸结合以及类固醇激素刺激应答、磷酸化调节、基因转录后表达调控、转移酶活性调节等生殖相关的生物学过程中显著富集。可见,卵巢中表达量较高的miRNA,如miR-143和let-7b可能通过参与上述多种细胞信号通路或生物学过程而调控山羊生殖。