耐氧化胁迫发菜细胞驯化前后生长、代谢和多糖合成的比较研究

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实验室前期研究发现外源添加H2O2会同时提高发菜细胞内活性氧(ROS)含量和胞外多糖产量,并且胞外多糖产量与胞内ROS含量与存在显著相关性。基于此,本文设计不断提高外源添加H2O2浓度的策略进行传代驯化,获得了耐氧化胁迫的发菜细胞,研究了驯化前后发菜细胞生长代谢和多糖生产的变化,并利用转录组学和代谢组学的手段进一步探究了发菜多糖产量提高的可能机理,进而对驯化前后发菜细胞的耐受性能进行了比较,同时对驯化前后发菜细胞多糖的结构、性质与体外抗氧化活性进行了对比。得到如下结果:(1)通过不断提高外源添加H3O2浓度的方法传代驯化获得高产多糖的耐氧化胁迫发菜细胞。驯化结束后获得的耐氧化胁迫发菜细胞总多糖产量分别增加了27%。驯化过程中,发菜细胞的生物量没有明显的变化,丙二醛(MDA)和活性氧(ROS)含量显著提高,抗氧化系统中酶促系统和非酶促系统各项指标显著提高,说明发菜细胞内大量ROS积累,氧化还原平衡被打破,细胞受到了氧化胁迫;抗氧化系统水平的提高是发菜细胞的一种氧化应激反应,以清除细胞内多余的活性氧,保护细胞。将驯化获得的耐氧化胁迫发菜细胞在无H2O2条件下培养,仍能正常生长,且多糖产量提高 3 2%。(2)利用Illumina高通量测序技术对驯化获得的耐氧化胁迫发菜细胞(AH)和正常条件下培养的发菜细胞(NC)进行转录组测序。与NC相比,AH共得到505个差异表达基因,其中252个基因上调,253个基因下调。根据差异基因的KEGG pathway富集分析结果表明,差异基因主要富集到能量代谢,氨基酸代谢,碳水化合物代谢等代谢通路中。结果表明:能量代谢的差异基因表达分析表明电子传递链的速率加快,导致了细胞内ROS的过度积累;多糖合成相关基因的差异表达分析表明AH可能通过加快CO2的固定,促进碳代谢,进而促进多糖的分泌;此外,糖基转移酶基因的差异表达也表明氧化胁迫条件影响了发菜细胞多糖的糖基组装。(3)利用GC/MS在AH和NC内共检测到64种代谢物,其中包括1 3种糖类,14种有机酸,10种脂肪酸,9种氨基酸和12种醇类和6种其他类。通过分析,主成分分析(PCA)和偏最小二乘判别分析(PLS-DA)得分图都呈现出明显的离散分组现象。结果表明:AH通过促进脂肪酸代谢、氨基酸代谢和糖代谢应对氧化胁迫。非酶类抗氧化剂甘露醇和甘油的含量均显著提高,可能是用来清除发菜细胞内产生的过剩的活性氧。(4)通过对AH和NC在NaCl、高光强、高H2O2胁迫条件下的耐受性进行比较。发现AH在受到胁迫时具有更好的适应能力。在NaCl、高H2O2胁迫条件下,随着胁迫程度的加深,多糖产量也随之增加,这也说明了 ROS水平上调可能会促进发菜多糖产量的增加。而AH可清除细胞内过剩的ROS,因此在相同条件下,与NC比,AH多糖的产量降低,说明AH有更好的耐受性,能更好的适应高NaCl、高H2O2的胁迫条件。(5)利用DEAE-650M纤维素阴离子交换色谱柱对发菜多糖分离纯化.测得NC-CPS、AH-CPS 2 种发菜多糖组分分子量分别为 1.370×103KDa、1.972×103Kda,乌式粘度计测得NC-CPS、AH-CPS2种发菜多糖特性粘度分别为14.3dL/g、21.8dL/g。红外光谱显示其具有多糖的特征吸收峰。体外抗氧化实验表明,耐氧化胁迫发菜细胞具有更好的羟基自由基和DPPH自由基的清除能力。
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