论文部分内容阅读
目的：
苯是工业生产和日常生活中常见的污染物，苯的血液毒性主要来自其活化代谢产物，如1,4-苯醌（1,4-BQ）。本课题组前期研究表明，1,4-BQ可诱导细胞内活性氧（ROS）升高、胞内酸化、线粒体功能紊乱、细胞自噬，甚至细胞凋亡。
外泌体是几乎所有细胞分泌的包含了复杂RNA和蛋白质的脂质双层膜小膜泡（30~150nm），其在生理、病理过程中发挥着重要作用。然而截至目前，还未见苯及其代谢产物与外泌体的相关研究报道。本研究旨在观察1,4-BQ能否对HL-60细胞外泌体释放特征产生影响，探讨外泌体分泌在1,4-BQ诱导的细胞毒性中的作用，为了解苯的毒性机制、降低苯的危害提供实验证据。
方法：
1.外泌体的提取和生物学鉴定：采用低温超高速离心法提取外泌体。透射电镜观察外泌体的形态，纳米粒径分析法（NTA）检测其粒径分布，蛋白质免疫印迹法（WB）检测外泌体标志蛋白CD9、CD63的表达。
2.外泌体和细胞中miRNA的检测：实时荧光定量PCR（qPCR）法检测外泌体和细胞中miRNA的含量。
3.ROS含量的检测：DCFH-DA荧光探针检测胞内ROS生成。
4.线粒体膜电位（MMP）的检测：JC-1检测试剂盒检测MMP。
5.细胞内pH的检测：BCECF-AM荧光分光光度法检测细胞内pH。
6.细胞凋亡的检测：AnnexinV-FITC/PI双荧光染料结合流式细胞术（FCM）定量评价细胞凋亡。
7.凋亡相关蛋白质表达的检测：WB法检测Bcl-2、cleaved-caspase9、cleaved-caspase3的表达。
结果:
1.外泌体的鉴定
结果显示提取的膜性囊泡呈圆形或椭圆形，粒径分布在30~150nm，中位粒径为131nm，CD9、CD63表达呈强阳性，且显著高于细胞的表达水平。证实提取的膜性囊泡为合格的外泌体，满足后续实验研究的要求。
2.1,4-BQ增加HL-60细胞外泌体的分泌量
为了观察1,4-BQ对细胞外泌体分泌量的影响，实验检测了0、2.5、5、10、20μM的1,4-BQ处理细胞24h时细胞培养液中外泌体量的变化。结果显示，0~10μM的剂量范围内外泌体的分泌量呈剂量依赖性增加。表明1,4-BQ能够促进HL-60细胞外泌体的分泌。
3.1,4-BQ改变外泌体荷载的miRNA的成分和含量
为了探讨1,4-BQ是否对外泌体荷载物的成分和含量产生影响，我们检查了10μM1,4-BQ处理细胞6h时，6种已被报道的与苯暴露有关的miRNA（miR-34a-3p、miR-34a-5p、miR-7-5p、miR-133a、miR-451a、miR-486-5p）在细胞和外泌体中的含量。结果显示，细胞和外泌体中，1,4-BQ染毒组的miR-7-5p、miR-133a、miR-451a、miR-486-5p含量均低于对照组。并观察到一个有趣的现象：无论染毒与否，细胞内均未检测到miR-34a-3p，但在外泌体中却呈高表达，且染毒组外泌体中的表达量高于对照组的2倍（P＜0.001）。虽然miR-34a-5p在细胞内表达，但染毒后表达量显著降低，在染毒组的外泌体内显著高于对照组（P＜0.001）。综上结果表明1,4-BQ能够改变外泌体荷载的miRNA的成分和含量。
4.抑制外泌体分泌加重1,4-BQ诱导的ROS
为了探究外泌体分泌在1,4-BQ诱导的ROS生成中的作用，我们检测了10μM、20μM1,4-BQ暴露的细胞在用或不用GW4869预处理时的ROS含量。结果显示：10μM、20μM1,4-BQ组ROS显著升高（P＜0.001）。而GW4869预处理显著提高了1,4-BQ诱导的ROS含量（P＜0.05），表明抑制外泌体分泌可加重1,4-BQ诱导的ROS含量。
5.抑制外泌体分泌加重1,4-BQ诱导的线粒体膜电位下降
为了解外泌体分泌在1,4-BQ诱导的线粒体膜电位下降中的作用，我们检测了在用或不用GW4869时，1,4-BQ暴露细胞的MMP水平。结果显示：10μM和20μM1,4-BQ组MMP均显著降低（P＜0.001），而GW4869干预显著加重了1,4-BQ诱导线粒体膜电位的下降（P＜0.01），表明抑制外泌体分泌可加重1,4-BQ诱导的线粒体膜电位下降。
6．抑制外泌体分泌加重1,4-BQ诱导的细胞内酸化
为了观察外泌体分泌在1,4-BQ诱导的细胞内酸化中的作用，我们检测了在用或不用GW4869时1,4-BQ诱导的细胞内酸化水平。结果显示：10μM和20μM1,4-BQ处理均可导致明显的细胞内酸化（P＜0.001），而GW4869干预则更加重了1,4-BQ诱导的细胞内酸化水平（P＜0.01），表明抑制外泌体分泌可加重1,4-BQ诱导的细胞内酸化。
7.抑制外泌体分泌加重1,4-BQ诱导的细胞凋亡
为了评估外泌体分泌在1,4-BQ诱导的细胞凋亡中的作用，我们检测了在用或不用GW4869时，1,4-BQ诱导的细胞凋亡水平。结果显示：20μM1,4-BQ处理组细胞凋亡显著增加（P＜0.05），而GW4869干预则加剧了1,4-BQ诱导的细胞凋亡（P＜0.05），表明抑制外泌体分泌可增加1,4-BQ诱导的细胞凋亡。
结论:
苯的活性代谢物1,4-BQ能改变HL-60细胞外泌体的分泌特征（成分和含量），抑制外泌体分泌可加重1,4-BQ诱导的细胞毒性，提示外泌体分泌在维持细胞稳态中起重要作用。
苯是工业生产和日常生活中常见的污染物，苯的血液毒性主要来自其活化代谢产物，如1,4-苯醌（1,4-BQ）。本课题组前期研究表明，1,4-BQ可诱导细胞内活性氧（ROS）升高、胞内酸化、线粒体功能紊乱、细胞自噬，甚至细胞凋亡。
外泌体是几乎所有细胞分泌的包含了复杂RNA和蛋白质的脂质双层膜小膜泡（30~150nm），其在生理、病理过程中发挥着重要作用。然而截至目前，还未见苯及其代谢产物与外泌体的相关研究报道。本研究旨在观察1,4-BQ能否对HL-60细胞外泌体释放特征产生影响，探讨外泌体分泌在1,4-BQ诱导的细胞毒性中的作用，为了解苯的毒性机制、降低苯的危害提供实验证据。
方法：
1.外泌体的提取和生物学鉴定：采用低温超高速离心法提取外泌体。透射电镜观察外泌体的形态，纳米粒径分析法（NTA）检测其粒径分布，蛋白质免疫印迹法（WB）检测外泌体标志蛋白CD9、CD63的表达。
2.外泌体和细胞中miRNA的检测：实时荧光定量PCR（qPCR）法检测外泌体和细胞中miRNA的含量。
3.ROS含量的检测：DCFH-DA荧光探针检测胞内ROS生成。
4.线粒体膜电位（MMP）的检测：JC-1检测试剂盒检测MMP。
5.细胞内pH的检测：BCECF-AM荧光分光光度法检测细胞内pH。
6.细胞凋亡的检测：AnnexinV-FITC/PI双荧光染料结合流式细胞术（FCM）定量评价细胞凋亡。
7.凋亡相关蛋白质表达的检测：WB法检测Bcl-2、cleaved-caspase9、cleaved-caspase3的表达。
结果:
1.外泌体的鉴定
结果显示提取的膜性囊泡呈圆形或椭圆形，粒径分布在30~150nm，中位粒径为131nm，CD9、CD63表达呈强阳性，且显著高于细胞的表达水平。证实提取的膜性囊泡为合格的外泌体，满足后续实验研究的要求。
2.1,4-BQ增加HL-60细胞外泌体的分泌量
为了观察1,4-BQ对细胞外泌体分泌量的影响，实验检测了0、2.5、5、10、20μM的1,4-BQ处理细胞24h时细胞培养液中外泌体量的变化。结果显示，0~10μM的剂量范围内外泌体的分泌量呈剂量依赖性增加。表明1,4-BQ能够促进HL-60细胞外泌体的分泌。
3.1,4-BQ改变外泌体荷载的miRNA的成分和含量
为了探讨1,4-BQ是否对外泌体荷载物的成分和含量产生影响，我们检查了10μM1,4-BQ处理细胞6h时，6种已被报道的与苯暴露有关的miRNA（miR-34a-3p、miR-34a-5p、miR-7-5p、miR-133a、miR-451a、miR-486-5p）在细胞和外泌体中的含量。结果显示，细胞和外泌体中，1,4-BQ染毒组的miR-7-5p、miR-133a、miR-451a、miR-486-5p含量均低于对照组。并观察到一个有趣的现象：无论染毒与否，细胞内均未检测到miR-34a-3p，但在外泌体中却呈高表达，且染毒组外泌体中的表达量高于对照组的2倍（P＜0.001）。虽然miR-34a-5p在细胞内表达，但染毒后表达量显著降低，在染毒组的外泌体内显著高于对照组（P＜0.001）。综上结果表明1,4-BQ能够改变外泌体荷载的miRNA的成分和含量。
4.抑制外泌体分泌加重1,4-BQ诱导的ROS
为了探究外泌体分泌在1,4-BQ诱导的ROS生成中的作用，我们检测了10μM、20μM1,4-BQ暴露的细胞在用或不用GW4869预处理时的ROS含量。结果显示：10μM、20μM1,4-BQ组ROS显著升高（P＜0.001）。而GW4869预处理显著提高了1,4-BQ诱导的ROS含量（P＜0.05），表明抑制外泌体分泌可加重1,4-BQ诱导的ROS含量。
5.抑制外泌体分泌加重1,4-BQ诱导的线粒体膜电位下降
为了解外泌体分泌在1,4-BQ诱导的线粒体膜电位下降中的作用，我们检测了在用或不用GW4869时，1,4-BQ暴露细胞的MMP水平。结果显示：10μM和20μM1,4-BQ组MMP均显著降低（P＜0.001），而GW4869干预显著加重了1,4-BQ诱导线粒体膜电位的下降（P＜0.01），表明抑制外泌体分泌可加重1,4-BQ诱导的线粒体膜电位下降。
6．抑制外泌体分泌加重1,4-BQ诱导的细胞内酸化
为了观察外泌体分泌在1,4-BQ诱导的细胞内酸化中的作用，我们检测了在用或不用GW4869时1,4-BQ诱导的细胞内酸化水平。结果显示：10μM和20μM1,4-BQ处理均可导致明显的细胞内酸化（P＜0.001），而GW4869干预则更加重了1,4-BQ诱导的细胞内酸化水平（P＜0.01），表明抑制外泌体分泌可加重1,4-BQ诱导的细胞内酸化。
7.抑制外泌体分泌加重1,4-BQ诱导的细胞凋亡
为了评估外泌体分泌在1,4-BQ诱导的细胞凋亡中的作用，我们检测了在用或不用GW4869时，1,4-BQ诱导的细胞凋亡水平。结果显示：20μM1,4-BQ处理组细胞凋亡显著增加（P＜0.05），而GW4869干预则加剧了1,4-BQ诱导的细胞凋亡（P＜0.05），表明抑制外泌体分泌可增加1,4-BQ诱导的细胞凋亡。
结论:
苯的活性代谢物1,4-BQ能改变HL-60细胞外泌体的分泌特征（成分和含量），抑制外泌体分泌可加重1,4-BQ诱导的细胞毒性，提示外泌体分泌在维持细胞稳态中起重要作用。