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水稻产量的提高过程,实质上是“源、库、流性状的遗传改良与其平衡关系不断建立的过程。选育源强、库大、流通畅的高光效的理想株型品种是水稻高产、稳产的重要保障。研究控制“源、库、流”多性状的关键基因及其遗传机理,对高产、优质水稻品种的选育具有重要的理论和实践意义。近几年,通过对水稻突变体的研究,克隆了一大批有关叶片,穗部和籽粒大小性状的关键基因,但目前对同时控制“源、库、流”的关键基因研究较少。本文报道了一个来源于水稻中花-11的天然突变体ess1,其表现为叶片早衰、株高变矮花粉育性降低、产量明显降低:电镜观察发现突变体ess1叶和茎的叶绿体、维管束发生严重畸变;叶绿素测定和抗氧化酶活力测定表明突变体ess1的叶片中的叶绿素含量抗氧化酶活力都有很大程度降低;遗传分析发现该突变体的这些水稻库源流性状的改变由单基因(位点)突变所致;利用分子标记将该突变基因精细定位于57KB范围内,逃一步分析发现基因LOCOs05948360是控制水稻“源-库-流”的关键基因。这些研究结果为理解整个水稻生长发育、衰老以及影响水稻源、库、流分配的分子机制打下基础。主要结果如下:
1.田间农艺性状调查结果表明,与野生型中花-11相比,突变体ess1的株高降低20.g%,二级枝梗数减少46.1%,有效穗数减少73.5%,实粒数减少87.5%,倒一节间变短19.5%,千粒重减少18.1%,生育期延长8天;I2-KI染色的结果表明,突变体ess1中的可育花粉数极显著低于野生型中花-11;通过水培实验可发现,突变体ess1的根系明显较野生型不发达。
2.我们通过扫描电镜观察重要组织的维管束,发现在突变体ess1的叶片和茎秆中的维管束发育畸形、结构不完整,严重影响了同化物、水和无机盐的运输:通过透射电镜观察叶绿体的形态,在苗期中的突变体ess1出现表型部分的叶绿体出现嗜锇颗粒,这一现象在分蘖期时更为严重,发展到抽穗期时叶绿体出现间隙,而野生型中花-11的叶绿体形态结构正常。
3.利用ess1分别和日本晴、93-11和蜀恢527做杂交构建遗传群体,并对其F2遗传分离群体进行表型调查,结果发现正常植株和突变植株的比例经卡方检验符合3∶1的比例,同时调查发现所有突变单株都同时具有早衰和源库流性状变化,如株高变矮、穗长变短、二级枝梗数和实粒数减少等,这一结果表明,控制该突变体的早衰和源库流性状变化是同一单基因突变所致,并呈隐性遗传。
4.利用9311/ess1的F2作图群体,对突变体ess1进行分子标记定位,最终将Ess1定位在5号染色体短臂上靠近端粒的区,位于Indel分子标记16和18之间,其物理距离为57.68KB。
5.利用RiceGenomeAnnotationProject数据库对定位区问内的基因进行预测,共获得9个基因。其中LOCOs05948390为已克隆的与叶尖坏死相关的基因,但是通过扩增其eds全长和启动子区域并没发现有突变位点,表达量在突变体和野生型之间差异也不明显,故将其排除掉。通过调查定位区间内的基因的表达谱,发现LOCOs05g48360特异地在根和叶片中表达量很高,通过聚类分析发现了其同源的拟南芥中基因AT1G28380,它们都编码一个含有MACPF功能域的蛋白,且AT1G28380的突变体也变现出早衰。故推测该基因可能是控制ess1突变表型的一个新基因。
6.选择分析了4个衰老相关基因(SAR)突变体ess1和野生型中花-11中的表达情况,结果显示4个衰老相关基因的表达在突变体ess1中都明显升高,其中Os1295、Os155和Os120的表达量是在突变体出现表型后上升,而Osh69的表达量在表型出现之前就特异性地升高,这些结果表明衰老基因Os1295、Os155、Os120和Os69都参与了水稻ess1的衰老过程,其中Osh69参与到ess1的早衰过程的初期阶段。
1.田间农艺性状调查结果表明,与野生型中花-11相比,突变体ess1的株高降低20.g%,二级枝梗数减少46.1%,有效穗数减少73.5%,实粒数减少87.5%,倒一节间变短19.5%,千粒重减少18.1%,生育期延长8天;I2-KI染色的结果表明,突变体ess1中的可育花粉数极显著低于野生型中花-11;通过水培实验可发现,突变体ess1的根系明显较野生型不发达。
2.我们通过扫描电镜观察重要组织的维管束,发现在突变体ess1的叶片和茎秆中的维管束发育畸形、结构不完整,严重影响了同化物、水和无机盐的运输:通过透射电镜观察叶绿体的形态,在苗期中的突变体ess1出现表型部分的叶绿体出现嗜锇颗粒,这一现象在分蘖期时更为严重,发展到抽穗期时叶绿体出现间隙,而野生型中花-11的叶绿体形态结构正常。
3.利用ess1分别和日本晴、93-11和蜀恢527做杂交构建遗传群体,并对其F2遗传分离群体进行表型调查,结果发现正常植株和突变植株的比例经卡方检验符合3∶1的比例,同时调查发现所有突变单株都同时具有早衰和源库流性状变化,如株高变矮、穗长变短、二级枝梗数和实粒数减少等,这一结果表明,控制该突变体的早衰和源库流性状变化是同一单基因突变所致,并呈隐性遗传。
4.利用9311/ess1的F2作图群体,对突变体ess1进行分子标记定位,最终将Ess1定位在5号染色体短臂上靠近端粒的区,位于Indel分子标记16和18之间,其物理距离为57.68KB。
5.利用RiceGenomeAnnotationProject数据库对定位区问内的基因进行预测,共获得9个基因。其中LOCOs05948390为已克隆的与叶尖坏死相关的基因,但是通过扩增其eds全长和启动子区域并没发现有突变位点,表达量在突变体和野生型之间差异也不明显,故将其排除掉。通过调查定位区间内的基因的表达谱,发现LOCOs05g48360特异地在根和叶片中表达量很高,通过聚类分析发现了其同源的拟南芥中基因AT1G28380,它们都编码一个含有MACPF功能域的蛋白,且AT1G28380的突变体也变现出早衰。故推测该基因可能是控制ess1突变表型的一个新基因。
6.选择分析了4个衰老相关基因(SAR)突变体ess1和野生型中花-11中的表达情况,结果显示4个衰老相关基因的表达在突变体ess1中都明显升高,其中Os1295、Os155和Os120的表达量是在突变体出现表型后上升,而Osh69的表达量在表型出现之前就特异性地升高,这些结果表明衰老基因Os1295、Os155、Os120和Os69都参与了水稻ess1的衰老过程,其中Osh69参与到ess1的早衰过程的初期阶段。