MicroRNA(miRNA)是一类大小约为22nt左右的小RNA分子，它们通过RNA聚合酶Ⅱ转录，并经过Drosha和Dicer酶切割形成成熟体，通过转录后抑制靶基因的表达来实现其调控作用。迄今为止，已有20000多条miRNA被发现，它们广泛涉及到生物体几乎所有的生理活动中。近年来，家蚕miRNA的研究也正在逐步开展，多国科学家共鉴定了562个家蚕成熟体miRNA，并通过微阵列芯片、深度测序等技术对家蚕miRNA的时空表达情况进行了调查，这就为进一步的功能研究奠定了良好的基础。　　 MiR-l是一种进化上较为保守的miRNA，其他物种中的相关研究表明，miR-l主要参与肌组织的发育和增殖分化、离子通道的调控、肿瘤的抑制以及病毒的复制等生理过程。家蚕中也存在有miR-l，其成熟体序列长度为22nt，主要在头、体壁等组织中表达。那么在家蚕中，miR-l究竟有什么样的生物学功能?它的靶基因有哪些?为了回答这两个问题，我们设计了以下的研究方案：通过miR-l模拟物上调家蚕体内miR-l的水平，观察可能出现的异常表型；通过基因芯片技术调查注射miR-l模拟物的家蚕基因的差异表达；预测家蚕miR-l的靶基因，结合芯片数据寻找可能的靶基因；通过mRNA水平和蛋白水平检测，以及双荧光素酶报告系统来验证miR-l的靶基因。通过该方案，获得的主要研究结果如下：　　 (1)上调Bmo-miR-l导致家蚕蜕皮障碍　　 家蚕幼虫吐完丝后身体缩短成为预蛹，经过2到3天蛹皮形成并蜕皮形成蛹。在预蛹期注射miR-l模拟物的家蚕不能蜕去旧表皮，透过半透明的的旧表皮可以看到内部蛹内表皮的形成受到的影响不是很大。剥开旧表皮可以发现内部是一个变形的蛹，由于头胸部旧表皮束缚的原因在蛹头胸部有一明显的缢痕，并且翅残缺不全。新旧表皮间有少量液体存在，液体中可能含有多种酶类，可以造成蛹表皮的损坏。人工剥开外表皮的蛹仍可以存活若干天，但在化蛾前死亡。推测可能是由于蛹表皮不完整导致水分丧失过快而造成。　　 (2)Bmo-miR-l mimics引起大量基因差异表达　　 家蚕蜕皮是由多个生化和生理过程组成，必然要涉及到成百上千基因的协同作用。微阵列芯片检测发现，共有1450个基因被检测到差异表达，包括814个上调基因和636个下调基因。GO分类结果表明，其中有614个基因具有1条以上的GO注释，总共涉及到19个GO二级分类，细胞过程、生理过程、催化活性和代谢为4个最为富集的GO类目，说明大量涉及到基础代谢和生理过程的基因受到影响。进一步分析，发现结构分子活性、免疫系统进程、胞外区域等类目下差异基因较为富集，而生长、迁移类目下只有下调基因，说明家蚕的生长和表皮结构的形成维持受到了影响。同时，表皮的受损导致体表屏障出现缺陷，从而诱发免疫系统的激活。对255个表皮蛋白的差异表达分析发现，有132个表皮蛋白检测到有表达，其中与几丁质结合有关的RR-1和RR-2家族分别有85％和75％的成员下调表达，而与几丁质无关的CPG、Tweedle和CPFL家族均无明显下调。CPH家族结构和功能较为多样，其家族成员上下调基因数目也较为接近。由此可以猜测蜕皮异常表型产生的原因可能部分归结为表皮蛋白基因表达模式的改变所导致的几丁质-表皮蛋白相互作用的异常。　　 (3)下调基因中包括部分预测的bmo-miR-l靶基因　　 靶基因的预测是miRNA功能研究必不可少的环节。通过对已有的家蚕3’UTR数据库进行预测，得到87个潜在bmo-miR-l靶基因，很多靶基因在家蚕和其他物种间存在保守性，比如vATPase家族两个成员(BmATP6v0c1和BmATP6v0d1)和胶转蛋白TAGLN。结合基因差异表达数据，我们发现有18个潜在的靶基因转录水平下调。其中就包括上述3个保守的bmo-miR-l靶基因。发现家蚕几丁质酶基因BmChi既是bmo-miR-l潜在的靶基因又有5倍左右的下调，我们推测该基因可能受到bmo-miR-l的抑制。　　 (4)家蚕几丁质酶基因BmChi是bmo-miR-l的靶基因　　 为了进一步研究BmChi和家蚕miR-l的关系，我们原核表达了BmCHI，纯化并制备多克隆抗体。芯片数据、半定量RT-PCR和western blot从mRNA和蛋白水平上都证实了注射bmo-miR-l的家蚕中BmChi的表达受到明显抑制。我们又构建了双荧光素酶报告载体，检测并发现bmo-miR-l可以通过BmChi3’UTR来影响报告基因的表达。在潜在的靶位点中，位于356位的靶位点1对miRNA介导的抑制作用贡献较小。这几方面的证据共同说明了BmChi是bmo-miR-l的靶基因。　　 (5)BmChi在家蚕蜕皮过程起重要作用　　 通过多个昆虫之间的同源比对和系统进化分析，我们预测了八个家蚕GH18家族几丁质酶基因，分别为BmChi、BmChiR1、BmCHT2、BmCHT6、BmCHT6b、BmCHT11、BmIDGF和BmCHT12，在编码蛋白的结构上每个基因都有其特点。根据其他物种中同源基因功能推测，这些基因可能和家蚕的蜕皮、羽化、围食膜的降解等有关。BmChi的时期表达谱显示，BmChi主要是在蜕皮期前上调表达，盛食期表达量较低或没有表达，推测其可能与蜕皮过程中表皮几丁质组分的降解有关。而注射bmo-miR-l的家蚕也同样是由于旧表皮组分不能降解，导致出现蜕皮障碍的表型。