食管癌是我国最常见的恶性肿瘤之一,河南省林州市食管癌的发病率高达108.6/10万。食管癌侵袭性强,进展迅速且多伴有淋巴结转移,易复发,预后差。常规手术治疗及放、化疗效果均不尽如意,所以,寻求治疗食管癌的新方法为当前研究热点。　　 哺乳动物雷帕霉素靶(mammalian target of rapamyein,mTOR)是一种非典型的丝氨酸/苏氨酸(Ser/Thr)激酶,也是一种重要的信号转导分子,其基因定位于1p36.2,编码的蛋白质由2,549个氨基酸组成,分子量为289kDa。mTOR能感受营养、能量等信号,在调节细胞生长与增殖等细胞基本功能活动中起着关键作用。研究表明,mTOR信号通路异常与乳腺癌、肾细胞癌,肺癌等肿瘤的发生密切相关。所以,mTOR已成为当前肿瘤治疗的新靶点。　　 缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)是HIF-1的活性亚基,与肿瘤血管的生成密切相关。VEGF在肿瘤血管、淋巴管生成的各个环节中均起着重要作用,VEGF-C是VEGF的一个亚型,不仅能促进淋巴管的生成和扩张,还可以增加血管的通透性。VEGF是HIF-1通路下游的一个靶基因,其表达受HIF-1α的调节。另有报道表明,在一些肿瘤中,mTOR与HIF-1α的表达呈正相关。　　 雷帕霉素(Rapamycin,RAPA)是一种大环内酯类抗生素,也是mTOR特异性抑制剂。雷帕霉素进入细胞后能能与FKBP(FK506结合蛋白)结合形成复合物,该复合物能抑制mTOR的表达。研究证实,雷帕霉素不仅有较强的免疫抑制作用,还具有一定的抗肿瘤作用。　　 RNA干扰(RNA interference,RNAi)是一种双链RNA(double-stranded RNA,dsRNA)分子在mRNA水平沉默相应序列基因的表达的过程,它通过21-23nt的dsRNA或发夹状RNA(hort hair pin RNAs,shRNAs)与特异性mRNA结合导致靶基因的降解,进而抑制目的基因的表达。RNAi技术以其快速、高效、操作简单等特点被广泛应用于基因功能的研究及疾病的基因治疗。　　 本研究用雷帕霉素及mTOR siRNA处理食管癌EC9706细胞,采用免疫细胞化学技术检测细胞中mTOR及HIF-1α、VEGF、VEGF-C蛋白的表达；采用原位杂交技术检测细胞中mTOR mRNA的表达；采用MTT法检测细胞生长情况,采用流式细胞术检测细胞周期的变化；采用流式细胞技术、TUNEL法检测细胞凋亡率的变化。为分子靶向治疗食管癌提供了实验基础和理论依据。　　 材料和方法：　　 1.人食管癌EC9706细胞株由中国医学科学院分子肿瘤学国家重点实验室惠赠。　　 2.食管癌EC9706的培养。　　 3.mTOR siRNA的体外合成、鉴定及筛选。　　 4.人食管癌EC9706细胞复苏、孵育、传代分组。雷帕霉素单独处理组:用100、150和200nM(低、中和高浓度)的雷帕霉素分别处理EC9706细胞24h、48h、72h；mTOR siRNA(m.siRNA)单独处理组:用50、100和150nM(低、中和高浓度)的mTOR siRNA分别转染EC9706细胞24h、48h、72h；顺铂(DDP)单独处理组(3mg/L)；联合处理组:mTOR siRNA联合雷帕霉素处理组(m.siRNA& RAPA,100nM的mTOR siRNA转染24h后加200nM的雷帕霉素再作用24h),mTOR siRNA联合顺铂处理组(m.siRNA& DDP,100nM的mTOR siRNA转染24h后加3mg/L的顺铂再作用24h)及雷帕霉素联合顺铂处理组(RAPA& DDP,150nM的雷帕霉素、3mg/L的顺铂同时作用24h):同时设正常对照组(常规培养液),无关对照组(转染无关siRNA序列)及溶剂对照组(DMSO)。　　 5.采用免疫细胞化学PV法检测各组EC9706细胞mTOR蛋白的表达情况,检测各单独处理组作用48h、各联合处理组及相应单独处理组细胞HIF-1α、VEGF及VEGF-C蛋白的表达情况。　　 6.采用细胞原位杂交技术检测各组EC9706细胞mTOR mRNA的表达情况。　　 7.采用MTT法检测各组对细胞生长抑制率的影响。　　 8.采用流式细胞技术检测各单独处理组作用48h、各联合处理组及相应单独处理组细胞周期的变化。　　 9.采用流式细胞技术及TUNEL法检测各单独处理组作用48h、各联合处理组及相应单独处理组细胞凋亡的变化情况。　　 10.统计学处理:应用SAS9.1.3统计软件进行统计学处理。　　 结果：　　 1.细胞形态学改变　　 各对照组细胞形态较一致,细胞均呈不规则多边形,轮廓清晰。与各对照组细胞相比,雷帕霉素处理后,细胞变小变长,有的呈梭形,并出现漂浮细胞,细胞生长变慢,这些变化随着药物浓度的增加、时间延长更加明显；转染mTORsiRNA后的细胞发生皱缩,体积变小,细胞边界模糊,间隙增宽,悬浮细胞增加,随着转染浓度的增加和时间的延长,上述变化更加明显；其余各组细胞形态也均有相应得变化。　　 2.免疫细胞化学结果　　 2.1各组细胞中mTOR蛋白的表达　　 与各对照组相比,雷帕霉素(F=106.87、60.86、60.86,P均<0.0001)及mTOR siRNA(F=24.14、45.78、59.19,P均<0.0001)单独处理组细胞中mTOR蛋白的表达均有所下降,差异均有统计学意义,且均有浓度依赖性和时间依赖性(FRAPA=11.68、5.20、26.9,P=0.0002、0.0123、0.0001；Fm.sjRNA=50.22、42.23、29.46,P均<0.0001),顺铂单独处理组细胞中mTOR蛋白表达无明显变化(P>0.05)；mTOR siRNA联合雷帕霉素处理组(2.24±0.43)与正常对照组相比(7.04±1.21),细胞mTOR蛋白的表达均明显减弱,且比各相应单独处理组(m.siRNA:3.97±0.48;RAPA:4.69±0.45)减弱更明显,差异均有统计学意义(P均<0.05)。　　 2.2各组细胞中HIF-1α、VEGF及VEGF-C蛋白的表达　　 与各对照组相比,各处理组细胞中HIF-1α(FRAPA=4740.81,P<0.001;Fm.siRNA=2072.36,P<0.001)、VEGF(FRAPA=2498.45,P<0.001；Fm.siRNA=2202.21,P<0.001)及VEGF-C(FRAPA=5321.03,P<0.001；Fm.siRNA=24770.37,P<0.001)蛋白均明显减弱,且差异均有统计学意义,各联合处理组与相应单独处理组相比,HIF-1α(RNA& RAPA vs m.siRNA、RAPA:2.00±0.02 vs3.12±0.04、3.26±0.06)、VEGF(m.siRNA& DDP vs m.siRNA、DDP:1.99±0.03 vs3.12±0.04、4.24±0.01)、及VEGF-C(RAPA& DDP vs RAPA、DDP:2.91±0.03 vs3.12±0.04、4.24±0.01)蛋白的表达均减弱,且差异均有统计学意义(P均<0.001)；Spearman相关性分析结果显示,EC9706细胞HIF-1α(r=0.93,P<0.05)、VEGF(r=0.95,P<0.05)及VEGF-C(r=0.94,P<0.05)的表达与mTOR的表达均呈显著正相关。　　 3.原位杂交结果　　 各组细胞中mTOR mRNA的表达情况与mTOR蛋白的表达一致。　　 4.各组细胞生长抑制率的比较　　 与各对照组相比,各处理因素对细胞的生长均有明显的抑制作用(P均<0.001),各对照组之间细胞生长的抑制率无明显差异(P均>0.05)；mTOR siRNA转染组中,随转染浓度的增加(F=78.77、76.14、52.25,P均<0.001),转染时间的延长(F=143.48、172.98、155.01,P均<0.001),对细胞生长的抑制作用增强,且不同浓度及不同时间段各组两两相比,差异均有统计学意义(P均<0.05)；雷帕霉素处理组中,同一时间段,随着雷帕霉素浓度(F=36.36、49.94、33.50,P均<0.0001)的增加,对细胞生长抑制率明显增加,且差异具有统计学意义(P均<0.05),同一浓度的雷帕霉素,随着作用时间(F=103.64、186.30、151.78,P均<0.0001)的延长,对细胞的抑制率也明显增加,且差异也均有统计学意义(P均<0.05)；各联合处理组细胞生长抑制率(m.siRNA& RAPA:33.15±0.03;m.siRNA&DDP:45.48±0.09；RAPA&DDP:27.30±0.11)明显高与相应各单独处理组(m.siRNA:27.30±3.76；RAPA:8.26±0.27；DDP:21.34±2.26),且差异均有统计学意义(P均<0.05)。　　 5.流式细胞技术检测细胞增殖情况　　 与各对照相比(G0/G1:53.11±0.61、52.87±0.85、53.27±0.90、53.45±0.85；S:18.85±0.89、19.37±1.03、18.85±0.89、18.55±1.44、18.57±1.14),各组各期细胞数所占的比例有所不同,G0/G1期的细胞的比例增加,S期的细胞比例减少,差别均有统计学意义(P均<0.05)；mTOR siRNA转染组中,随转染浓度的增加,G0/G0期细胞的比例增加(64.95±1.53,67.53±1.25,72.16±1.58),S期的细胞比例减少(20.03±1.27,18.48±1.48,14.38±1.59),且三个浓度之间的差异有统计学意义(P均<0.05)；雷帕霉素处理组中,G0/G1期细胞所占的比例随雷帕霉素的浓度增加而增加(64.81±1.46,66.69±0.87,73.52±1.48),S期的细胞比例随之减少(19.93±1.48,19.26±0.98,12.36±1.92),三个浓度两两之间的差异具有统计学意义(P均<0.05)；各联合处理组(m.siRNA&RAPA:82.89±0.76;m.siRNA& DDP:82.89±0.76；RAPA& DDP:71.71±0.56)中,G0/G1期细胞所占的比例高于各相应单独处理组(m.siRNA:15.16±1.68；RAPA:17.55±0.57；DDP:17.19±1.06),且差异有统计学意义(P均<0.05)。　　 6.TUNEL及流式细胞技术检测各组细胞凋亡情况　　 两种方法结果均显示,与各对照组相比(AI:1.92±0.15、1.87±0.15、0.89±0.17及2.28±0.15％；早期凋亡细胞:5.46±1.79、4.07±2.08、4.99±2.24及4.34±1.24％),雷帕霉素、mTOR siRNA各单独处理组细胞AI(RAPA:9.40±0.69、22.56±0.99、30.58±1.84；m.siRNA:10.17±0.51、10.17±0.51、35.35±1.48)及早期凋亡细胞率(4.82±1.15、14.07±1.15、29.76+2.89)、晚期凋亡率(14.81±1.50、24.13±3.02、30.11±7.00)均明显增加,且差异均有统计学意义(P均<0.05)。AI及凋亡率随浓度增加而增加,各浓度之间及间两两相比,差异均有统计学意义(P均<0.05)；各联合处理组中,细胞AI(m.siRNA& RAPA:26.5±10.16％:m.siRNA&DDP:39.78±0.14％；RAPA&DDP:40.02±0.14％)、早期凋亡率(m.siRNA& RAPA:26.69±0.41％；m.siRNA& DDP:28.88±0.44％；RAPA& DDP:19.09±1.29％及晚期凋亡率(m.siRNA& RAPA:28.28±0.59％；m.siRNA& DDP:29.33±0.54％；RAPA& DDP:26.13±1.91％)均高于各相应单独处理组细胞AI(RAPA:14.95±0.84,m.siRNA:22.56±0.99,DDP:26.96±4.12)、早期凋亡率(RAPA:19.09±1.29,m.siRNA:14.90±2.74,DDP:15.16±1.38)及晚期凋亡率(RAPA:15.83±1.74,m.siRNA:21.10±3.59,DDP:17.90±1.40),且差异均有统计学意义(P均<0.05)。　　 结论：　　 1.雷帕霉素、mTOR siRNA可特异性抑制食管癌EC9706细胞mTOR蛋白及mRNA的表达,同时下调HIF-1α、VEGF及VEGF-C蛋白的表达,提示雷帕霉素、mTOR siRNA可能抑制食管癌血管淋巴管的生成,从而抑制食管癌的浸润转移。　　 2.雷帕霉素、mTOR siRNA均可抑制细胞的生长,使细胞周期阻滞于G0/G1期,诱导细胞的凋亡。　　 3.雷帕霉素、mTOR siRNA具有明显的协同作用。　　 4.雷帕霉素、mTOR siRNA均可增加细胞对顺铂的敏感性。