论文部分内容阅读
重症失血性休克后的微循环障碍是顽固性低血压、多器官损伤的重要因素。淋巴循环作为机体循环系统的重要组成的一部分,对于维持机体自稳态起着重要的作用。淋巴管泵功能是淋巴循环的动力学基础,在体与离体实验均已表明,在休克的发展进程中,淋巴管收缩性出现双相变化,即早期升高,晚期降低,与重症休克的发展关系密切。如何调控淋巴管泵功能,进而调节淋巴循环,对于重症休克的防治具有积极意义。淋巴管泵功能受多种体液因子的调节。研究表明,一氧化氮(nitric oxide, NO)的周期性变化除了参与生理状态下淋巴管的收缩、舒张以及张力调节外,同样也参与了失血性休克发展进程中淋巴管泵功能的调节；ATP敏感性钾通道(ATP-sensitive K+channel, KATP)通过调节淋巴管平滑肌细胞去极化程度,来调控生理状态下淋巴管的泵功能。国外学者研究发现,NO部分通过cGMP/cAMP及其依赖的蛋白激酶(PKA/PKG)作用于KATP来调控正常淋巴管收缩性。那么,KATP在休克后NO调节淋巴管泵功能这一过程中是否发挥作用?值得研究。这对于以KATP为靶点,开展休克后淋巴管的生物学调控具有重要的意义。为此,本研究首先观察了cAMP、PKA、cGMP、PKG在休克发展进程中的变化,并进一步应用离体微血管压力-直径测定技术,观察KATP以及cAMP/PKA、cGMP/PKG、NO/NOS工具药对休克淋巴管收缩性及其对P物质(SP)反应性的影响,探讨KATPP在NO调节休克大鼠淋巴管泵功能中的作用与机制,为休克后淋巴管泵功能的调控提供实验依据与理论基础。首先,将126只Wistar雄性大鼠随机分为休克组(经股动脉放血,维持平均动脉血压至40mmHg,复制失血性休克模型,分为shock0h shock0.5h、shock1h、shock2h、shock3h亚组,均n=21)、对照组(control group,仅实施麻醉及与休克组相同的手术,n=21)。在对照组完成手术后稳定30min、休克大鼠各时间点,分离胸导管,手术显微镜下去除胸导管周围组织,留取淋巴管组织。每组取出12条淋巴管制备组织匀浆后,用ELISA法检测cAMP、cGMP、p-PKA、p-PKG含量；每组9条淋巴管提取蛋白后,用western blot技术测定PKG蛋白表达。研究结果显示,随着休克的发展,淋巴管组织中cAMP、p-PKA含量逐渐增高,两者均在shock0.5h及以后显著增高；同样,cGMP、p-PKG含量也逐渐增高,从shock2h始显著性增加,而PKG蛋白在Shock0h组显著高于control组,随着休克的发展,PKG蛋白含量下降至control组水平。其次,42只大鼠分为control组(n=6)、shock0.5h组(n=36),制备离体淋巴管条,固定于微脉管灌流系统的浴槽内,待淋巴管出现稳定的收缩后,维持淋巴管跨壁压在3cmH20水平,control、shock0.5h组的各6条淋巴管直接观察并记录淋巴管的收缩频率(contraction frequency,CF)及淋巴管各期口径,根据淋巴管收缩末期口径(end systolic diameters,ESD)、舒张末期口径(end diastolic diameters, EDD)、被动管径(passive (relaxed) diameters, PD)和频率,计算淋巴管紧张指数(tonic index, TI)、收缩幅度(contraction amplitude, CA)、泵流分数(fractional pump flow, FPF)等指标,结合CF评价淋巴管泵功能。余下shock0.5h组的30条离体淋巴管出现稳定的自发性收缩,分别与L-Arg(NO供体)、L-Arg+H89(PKA抑制剂)、L-Arg+Glibenclaimde (KATP阻断剂)、8-Br-cAMP(PKA供体)、8-Br-cAMP+Gli孵育10min后(均n=6),观察并记录淋巴管的CF、EDD和ESD,评价KATP在NO-cAMP-PKA通路调节失血性休克大鼠离体淋巴管泵功能中的作用。结果显示,shock0.5h淋巴管CF、FPF、TI显著高于对照组,与L-Arg共孵育后CF、FPF、TI显著降低,其中FPF、TI也显著低于对照组；shock0.5h淋巴管与H-89和L-Arg共孵育后,CF和FPF都显著高于shock0.5h+L-Arg组；shock0.5h淋巴管与Gli与L-Arg共孵育后FPF显著高于shock0.5h+L-Arg组;shock0.5h淋巴管与8-Br-cAMP孵育后,CF和FPF显著降低,shock0.5h淋巴管与8-Br-cAMP、Gli共孵育后,CF显著高于对照组。上述各组淋巴管收缩性观察结束后,进一步给予梯度浓度的SP,使终浓度分别为：1×10-8、3×10-8、1×10-7、3×10-7mol/L,测量淋巴管的EDD、ESD、CF和PD,计算CA、FPF和TI,将给予各浓度SP前后CF、 TI、CA、FPF的差值ACF、△TI、△CA,△FPF作为淋巴管反应性性的指标。结果显示,shock0.5h淋巴管在SP某些浓度下,△CF、△FPF与ATI显著高于对照组；L-Arg可降低shock0.5h淋巴管在部分SP浓度下的△CF、△FPF与△TI,而Gli与L-Arg共孵育后能够抑制L-Arg的作用并在某些浓度点下显著提高△CF、△FPF以及△TI,其中△CF在某些浓度点上显著高于对照组；8-Br-cAMP可降低shock0.5h部分SP浓度点下的△CF、△CA、△FPF以及△TI,显著低于对照组,Gli则抑制了8-Br-cAMP的作用,显著提高△CF、△FPF与△TI。结果提示KATP参与了NO对大鼠休克早期离体淋巴管泵功能的调节作用,其作用与NO-cAMP-PKA信号通路有关。最后,42只大鼠在复制失血性休克模型后,制备shock2h离体淋巴管条,观察shock2h离体淋巴管的收缩性与反应性(n=6),并以前述control组作为对照。余下shock2h组的36条离体淋巴管出现稳定的自发性收缩后,分别与L-NAME(NOS抑制剂)、ODQ (sGC抑制剂)、KT-5823(PKG抑制剂)、吡那地尔(KATP开放剂)孵育10min,具体分组情况为：shock2h+L-NAME、shock2h+L-NAME+pinacidil、shock2h+ODQ、shock2h+ODQ+pinacidil、shock2h+KT-5823、shock2h+KT-5823+pinacidil(均n=6),观察淋巴管的收缩性与反应性变化,探讨KATP在NO-cGMP-PKG通路调节失血性休克大鼠离体淋巴管泵功能中的作用机制。结果显示,shock2h淋巴管的CF、FPF、TI较对照组显著性降低,L-NAME可提高shock2h淋巴管的CF、FPF、TI,ODQ可提高shock2h淋巴管的CF、TI,KT5823可提高shock2h淋巴管的CF、FPF,降低了TI；而L-NAME、ODQ、 KT5823分别于吡那地尔共孵育后,分别能显著降低shock2h淋巴管单独与L-NAME孵育时的CF、FPF,降低与单独ODQ孵育时的CF、 FPF,并恢复CA至对照组水平,降低单独与KT-5823孵育时的CF、 FPF。同时发现,在某些SP浓度点,shock2h淋巴管的△FPF、△TI显著低于对照组,L-NAME可提高shock2h淋巴管的△CF、△FPF、△CA, ODQ可提高shock2h淋巴管的△CF、△TI、降低△FPF,KT-5823可提高shock2h淋巴管的△CF、△FPF、△TI;吡那地尔可降低L-NAME提高shock2h淋巴管的△CF、△FPF、△TI的作用,降低ODQ提高△CF的作用,并进一步提高了△CA、△TI,降低了KT-5823提高△CF的作用。结果提示NO通过NO-cGMP-PKG信号通路介导重症休克低收缩性与反应性的机制与KATP有关。总之,在失血性休克的发展进程中,淋巴管的收缩性与反应性表现为早期升高、晚期下降,KATP参与了NO对大鼠休克离体淋巴管泵功能的调节作用,其作用与NO-cAMP-PKA、NO-cGMP-PKG信号通路有关。以KATP作为药物靶点,可调节休克淋巴管的泵功能。