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研究背景:在所有妇科相关肿瘤类型引起的致死病因中,卵巢癌位于第一位。正常卵巢位于女性盆腔深处,临床上早期筛查手段效率低,卵巢癌患者确诊肿瘤时,多数已处于临床晚期,故5年存活率常低于30%。上皮性卵巢癌作为卵巢癌中最常见的一种类型,多在临床发现时,已浸润转移至盆腔或腹腔其他部位,因此现如今常规的治疗手段,如手术切除治疗、化疗或放疗,效果并不理想。因此阐明上皮性卵巢癌发生发展的分子调控机制,尤其是探讨上皮性卵巢癌远处浸润转移机制对于上皮性卵巢癌的早期诊断以及治疗有指导性意义。缺氧是公认的肿瘤所处的微环境,是由于肿瘤细胞的无节制增长导致组织缺氧,进而形成一个酸性的肿瘤微环境。尤其在实体肿瘤结构中,缺氧部位可横穿整个肿瘤组织。文献报道,缺氧诱导因子(Hypoxia inducible factor,HIF)是缺氧诱导的重要分子,HIF可促进肿瘤细胞的上皮间质化转变和远处侵袭转移。其中,缺氧诱导因子1α(Hypoxia inducible factor1 α,HIF1 α)调控肿瘤酸性微环境中碳酸酐酶9(Carbonic anhydrase,CA9)的表达,通过调控CO2水和反应,调节肿瘤细胞内外pH值,使得肿瘤细胞能够适应缺氧和缺氧所导致的酸性环境,在肿瘤发生、发展和浸润、远处转移发挥重要作用。上皮-间质化转变(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)进程对于肿瘤细胞的转移及后期进展的作用十分重要,其中就包括上皮性卵巢癌细胞。EMT可赋予上皮细胞间质细胞表型,导致细胞之间的粘附性降低、能动性增高,从而获得侵袭和远处转移的能力。而缺氧环境可进一步促进肿瘤细胞的EMT。抑制缺氧诱导的EMT可能是抑制肿瘤侵袭迁移的重要机制。Sohlh2(Spermatogenesis and oogenesis basic helix-loop-helix(bHLH)transcription factor 2)是bHLH家族的一个重要的转录因子。实验室前期研究显示,Sohlh2在卵巢表面上皮和输卵管上皮中表达较高,但其在上皮性卵巢癌组织中表达水平则明显降低。过表达Sohlh2,可通过调控不同分子机制抑制上皮性卵巢癌细胞的增殖、迁移和侵袭。这一结果表明Sohlh2是一个新.的抑癌基因。另外,最新研究发现Sohlh2可通过下调IL-8抑制人乳腺癌细胞的EMT。但是,Sohlh2对于缺氧诱导的上皮性卵巢癌EMT的作用及作用机制需进一步探讨。本实验通过体外培养上皮性卵巢癌细胞,利用化学乏氧剂氯化钴,模拟肿瘤细胞所处的缺氧微环境;通过Sohlh2基因转染和RNA干扰,利用划痕、Transwell迁移、Matrigel侵袭、免疫荧光染色、Western Blot等实验技术,检测Sohlh2在缺氧引起的上皮性卵巢癌细胞EMT及侵袭迁移中的作用,并进一步探讨其作用机制,以期可以为临床上该类肿瘤的治疗发现新的方向。方法施1.检测Sohlh2在缺氧状态下对上皮性卵巢癌细胞迁移侵袭的影响。体外培养人上皮性卵巢癌细胞株HO8910和SKOV3,采用基因转染及RNA干扰技术,过表达或敲减Sohlh2基因。将细胞分为以下几组:①①HO8910-pEGFP组;②HO8910-pSohlh2 组;③SKOV3-Con 组;④SKOV3-pShSohlh2 组,①②组细胞通过G418筛选,③④组细胞通过puromycin筛选,筛选时间为两周,构建稳转的Sohlh2过表达以及Sohlh2敲减细胞系。四组细胞中加入100μ M CoCl2缺氧处理48h。采用划痕、Transwell迁移、Matrigel侵袭实验,检测Sohlh2在缺氧状态的上皮性卵巢癌细胞迁移侵袭中的作用。2.检测Sohlh2对缺氧诱导的上皮性卵巢癌细胞上皮间质化转变过程的作用。采用 Western Blot 技术,检测 H08910-pEGFP 组、HO8910-pSohlh2 组、SKOV3-Con组、SKOV3-pShSohlh2组细胞经过100μM CoCl2缺氧处理48h后,上皮间质化转变标志物E-cadherin、Vimentin、N-cadherin和Sohlh2蛋白表达水平的变化;采用免疫荧光技术,检测H08910-pEGFP组和HO8910-pSohlh2组细胞经过缺氧处理后E-cadherin和Vimentin的蛋白表达水平的变化。3.探讨Sohlh2在缺氧诱导的上皮性卵巢癌细胞EMT中的作用机制。将 HO8910-pEGFP 组、HO8910-pSohlh2 组、SKOV3-Con 组、SKOV3-pShSohlh2 组细胞分别在正常氧气含量(25%02)及缺氧状态(100μ MCoC12)下进行培养,采用Western Blot技术,检测HIF1 α和CA9的蛋白表达水平。结果:1.经过缺氧处理48h后,与HO8910-pEGFP组相比,HO8910-pSohlh2组48小时细胞迁移的距离明显缩短(P<0.05);Transwell迁移和Matrigel侵袭实验结果显示:HO8910-pSohlh2组迁移、侵袭的细胞数明显减少(P<0.05)。经过缺氧处理48h后,与SKOV3-Con组相比,SK0V3-pShSohlh2组48小时细胞迁移的距离明显增加(P<O.05);Transwell迁移和Matrigel侵袭实验结果显示:SKOV3-pShSohlh2组迁移、侵袭的细胞数明显增多(P<0.05)。2.免疫荧光结果显示:经过缺氧处理48h后,与HO8910-pEGFP组相比,HO8910-pSohlh2组上皮性标志物E-cadherin蛋白表达明显增加,Vimentin蛋白表达降低。3.经过缺氧处理后,与HO8910-pEGFP组对比,上皮性标志物蛋白E-cadherin表达明显升高,间质性标志物Vimentin和N-cadherin蛋白表达明显降低;与SKOV3-Con组相比,SKOV3-pShSohlh2组上皮性标志物蛋白E-cadherin表达明显减少,Vimentin和N-cadherin表达升高。4.在正常氧气含量及缺氧状态下培养HO8910-pEGFP组和HO8910-pSohlh2组细胞,缺氧状态下HO8910细胞HIF1 α和CA9的蛋白表达明显高于正常氧气含量培养细胞的蛋白表达量;在正常氧气含量和缺氧状态下,与HO8910-pEGFP组对比,HO8910-pSohlh2组HIF1 α和CA9的蛋白表达量均明显降低。在正常氧气含量及缺氧状态下培养SKOV3-Con组和SKOV3-pShSohlh2组,缺氧状态下SKOV3细胞HIF1 α和CA9的蛋白表达量较正常氧气含量培养细胞的蛋白表达量高;在正常氧气含量和缺氧状态下,与SKOV3-Con组相比,SKOV3-pShSohlh2组HIF1 α和CA9的蛋白表达量均明显增加。结论:1.Sohlh2可抑制缺氧状态下上皮性卵巢癌细胞的迁移侵袭;2.Sohlh2可抑制缺氧状态下上皮性卵巢癌细胞的上皮间质化转变;3.Sohlh2可能是通过下调HIF1 α/CA9信号通路抑制缺氧状态下上皮性卵巢癌细胞的上皮间质化转变。