肌生成抑制素(Myostatin,MSTN)是近几年来发现的骨骼肌生长的负调控因子,其活性的丧失,会引起动物肌肉的过度发育,肌纤维直径变大或肌纤维数增加,表现为动物的“双肌”性状。在自然界中存在肌生成抑制素基因突变导致的比利时蓝牛和皮特蒙特牛的双肌表型,因此可以通过对肌生成抑制素的突变、缺失、敲除等遗传修饰,获得转基因克隆动物,以达到改进肌肉质量和重量的目的,生产具有商业化性质的优良品种家畜。1997年,“多莉”的诞生,开创了以体细胞为核供体克隆动物的先例。而胚胎成纤维细胞具有易分离、易培养、传代次数较多、体外培养时间长、核型较稳定等优点,可以满足筛选时体外培养时间长的要求,是目前最常用的用于基因打靶实验的供体细胞。本实验选用37天长白猪胚胎为材料,采用胶原酶消化的方法,分离原代成纤维细胞,用于基因打靶实验。将线性化的基因敲除载体,经脂质体LipofectamineTM2000介导,转染原代成纤维细胞。经G418筛选5~7天,G418和GANC筛选7~10天后获得双抗性细胞。抗性细胞经扩大培养后,部分冻存,部分用于鉴定。对筛选到的抗性细胞进行了PCR鉴定、Southern杂交鉴定,初步确定筛选到的细胞为基因敲除细胞,然后阳性细胞用于核移植。供体细胞与去核的卵母细胞融合后,在体外可以发育至囊胚,囊胚率为31%。