Pten(phosphate and tension homology deleted on chromsome ten)基因定位于人第10号染色体,编码由403个氨基酸组成、具有脂质磷酸酶活性和蛋白磷酸酶活性的抑癌蛋白PTEN。自1997克隆并鉴定为抑癌基因以来,其一直作为肿瘤研究领域的明星分子。多种肿瘤病人的组织中都发现了Pten基因的突变与缺失,并且生殖细胞中PTEN的缺失与突变会导致一组常染色体显性遗传综合征(PHTS),包括Cowden疾病和Bannayan–Riley–Ruvalcaba综合征。PTEN通过发挥磷酸酶活性能特异性将细胞质中的磷脂酰肌醇3,4,5三磷酸(PIP3)去磷酸化生成磷脂酰肌醇4,5二磷酸(PIP2),从而抑制PI3K-Akt信号通路发挥抑癌功能。PI3K信号通路的活性与肿瘤的易感性之间存在密切的关联,因此研究PTEN蛋白水平和活性的调控,对于肿瘤的治疗具有重要意义。除此以外,PTEN在细胞核中还可以通过不依赖PI3K信号通路的方式,维持基因组稳定性、调控细胞周期进程以及基因表达,发挥抑癌功能。PTEN是继p53后发现的另一个重要的抑癌蛋白,但相对于p53的“二次打击学说”,它具有自己独特的精细调控模式。为了研究PTEN剂量改变对其抑癌功能的影响,Pier Paolo Pandolfi实验室构建了表达不同PTEN蛋白水平的小鼠模型,当PTEN的蛋白水平降为80%,乳腺癌的发生率高达40%,而当PTEN的蛋白水平降为30%,乳腺癌的发生率攀升至75%。此外,他们还构建PTEN蛋白水平升高的小鼠(Super-PTEN小鼠),研究发现PTEN的蛋白水平与小鼠的体重呈负相关关系,PTEN的水平越高,小鼠体重越轻,体型越小,抗癌能力越强。这些研究均表明PTEN蛋白的剂量与其生理功能的维持密切相关。蛋白质的调控主要分三个层次:转录调控,转录后调控和翻译后调控。其中,蛋白质的翻译后调控是维持蛋白稳定性的重要途径。研究表明PTEN在发生磷酸化、乙酰化和泛素化等修饰后,会引起其磷酸酶活性、蛋白构象、亚细胞定位以及蛋白稳定性的改变。本课题主要关注的是PTEN的泛素化与去泛素化的调控过程,发生泛素化的蛋白通过泛素-蛋白酶体途径进行蛋白质的降解,而去泛素化过程可以拮抗这一过程。参与这两个重要过程的泛素连接酶与去泛素化酶就好像是天平的两端共同来调控蛋白质的稳态。目前报道的PTEN泛素连接酶(E3)共有5个:WWP2、CHIP、XIAP、Nedd4-1和TRIM27,去泛素化酶(DUB)共有3个:USP7、USP13和OTUD3。研究表明,TRIM27对PTEN的泛素化修饰能调节PTEN的磷酸酶活性,但并不影响PTEN的蛋白水平与定位;Nedd4-1虽然在分子水平和细胞水平证实了它不仅能单泛素化PTEN影响其亚细胞定位,并且还能多聚泛素化PTEN促进其降解,但有研究已经表明Nedd4-1敲除后并不影响PTEN泛素化水平及蛋白水平;生理水平下XIAP可以通过单聚泛素化促进细胞质PTEN转移到细胞核,并且还能多聚泛素化PTEN来调控PTEN的蛋白水平。但是,WWP2与CHIP在生理条件下是否能去除PTEN的多聚泛素化,调控PTEN的蛋白稳定性缺乏系统性的研究。为了解决这一问题,我们利用PTEN的泛素化连接酶WWP2与CHIP的单基因敲除小鼠模型进行研究,我们的研究结果主要有:(1)通过比较分析WWP2基因敲除小鼠与野生型小鼠,发现WWP2基因敲除小鼠体型较小,发育迟缓;(2)对小鼠的胚胎成纤维细胞进行分析发现,WWP2敲除后PTEN的泛素化水平降低,蛋白稳定性的增强,并且AKT通路受到抑制;(3)对CHIP基因敲除小鼠进行表型分析,发现CHIP缺失的小鼠出生率很低,并且出生后的小鼠体型明显减小,但是CHIP缺失的小鼠体内PTEN的泛素化水平和蛋白稳定性并未发生明显变化,提示CHIP对生长发育具有重要作用,但并不调控PTEN的蛋白稳定性;在PTEN去泛素化调控的研究上,已经发现了USP7能去除PTEN的单泛素化,调控PTEN的亚细胞定位,但并不调控PTEN的蛋白水平;USP13和OTUD3能去除PTEN的多聚泛素化,上调PTEN的蛋白水平,从而抑制肿瘤的发生发展。相比于PTEN泛素化研究,PTEN的去泛素化研究较少,USP10是我们实验室之前发现的PTEN的另一个去泛素化酶,前期研究已经证实USP10能通过去泛素化调控PTEN的蛋白的稳定性,但是由于前期数据量较少,并且缺乏小鼠模型的验证。因此,我们在前期研究的基础上进一步开展实验,研究结果主要有:(1)运用CRASPR/CAS9技术对H1299和MCF7进行USP10敲除进行克隆形成和细胞迁移实验,发现USP10能抑制肿瘤细胞的增值和迁移;(2)利用USP10基因敲除小鼠模型进行更进一步的研究,发现生理水平下USP10能通过去除PTEN的泛素化,调控PTEN的稳定性。我们的研究围绕PTEN这一重要抑癌蛋白的泛素化与去泛素化调控展开,研究证明了生理条件下,相对于CHIP而言,WWP2是PTEN更重要的E3。因此,WWP2比CHIP更适合作为肿瘤抑制剂开发的靶标。目前研究发现USP10与胰腺癌、食管癌和结直肠癌等的发生发展相关,以USP10作为目标分子进行肿瘤的诊断及靶向治疗非常有希望进入临床研究,因此我们的研究对肿瘤治疗药物的开发具有积极意义。