成牙本质细胞分化和牙本质形成的机制至今尚未完全明确。随着对牙髓牙本质复合体研究的逐步深入，对成牙本质细胞的需求已极为广泛，但由于天然成牙本质细胞数量有限，获取足够量的纯化的成牙本质细胞尚难以实现。因此，建立稳定的、克隆化的、具有成牙本质细胞生物学表型和功能的细胞系已成为急需。然而，人牙乳头组织来源的牙乳头外胚间充质细胞和(或)成牙本质细胞在通常的体外培养条件下经过十余次的传代后，就会停止分裂增殖，发生衰老和死亡。有学者在培养原代成牙本质细胞和／或牙乳头细胞的基础上，诱导其自发性永生化或转染永生化基因(如sV40大T抗原和HPV18 E6／E7等DNA肿瘤病毒)，建立了永生化的小鼠成牙本质细胞系和牛成牙本质细胞样细胞系，如MDPC-23、M06-G3，但仅具有成牙本质细胞的部分特征。同时，它们是肿瘤病毒诱导的永生化细胞系，有许多局限性：外源性基因的整合是随机的，其表达产物可干扰细胞内生理途径而发生非预期的改变；转染获得的是转化细胞而非正常细胞，其表型、核型等可发生改变；并非所有的细胞系都是“无限增殖”，有的仅渡过了衰老期(senescence，M1期)而延长了细胞寿命。 为了克服现有细胞系的缺点，本研究将人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase，hTERT)基因转染至原代人成牙本质细胞样细胞，激活端粒酶，细胞逾越M1期和危机期(crisis，M2期)而发生永生化，成功建立起永生化细胞系。由于hTERT激活端粒酶诱导细胞永生化的过程类似胚胎干细胞内存在的生理途径，故该永生化细胞系保留了更多的人成牙本质细胞的生物学特征和功能学特征。主要进行了如下几方面的研究： 一、人成牙本质细胞样细胞的原代培养 取8月龄合法引产胎儿，剥离乳磨牙胚牙乳头，组织块法培养。原代细胞作平板克隆，矿化液培养10天后，滤纸片法挑取了3个与成牙本质细 第四军医大学博士学位论文 胞形态相似的细胞克隆，扩大培养。其中克隆a来源的细胞呈梭形、未见 核极化，部分具有单侧较长细胞突起。同时它们在InRNA的水平上表达牙本 质基质蛋白 1（denim matrix protein，DMPI）和牙本质涎磷蛋白 （dent。n slalonhosnhonrotein，DSPP），具有较高碱性磷酸酶 （alkaline PhosPhatase，ALP）活性，在矿化液诱导下形成细胞结节并矿 化。因此，该培养细胞为人成牙本质细胞样细胞，为下一步的研究奠定了 基础。 二、永生化人成牙本质细胞样细胞系的建立 采用脂质体转染法，将编码 hTERT 和 neo 基因的真核表达质粒 pCIneo－hTERT导入原代培养的人成牙本质细胞样细胞。培养液加 G4lS筛 选约一个月后，抗性细胞克隆形成，滤纸片法转移、扩增，共获得5个细 胞克隆。hTERT稳定转染入细胞，表达mRNA及其蛋白质，同时细胞端粒酶 活性转为阳性。克隆sb来源的细胞在体外长期连续培养下生长良好，至今 传代达56代，约6个月，命名为hTERT介导的永生化人成牙本质细胞样细 胞系（hTERT－immortalized odontoblast－like cell line，hTERT－hod－ 工）。 三、永生化人成牙本质细胞样细胞系的生物学特征 体外连续培养过程中，hTERT－hodl 呈现成纤维细胞样形态，细胞器 发达，生长增殖活跃，具有克隆形成能力。同时，细胞核型正常，无裸鼠 致瘤性，在软琼脂内不能生长，血清依赖性无显著降低，仍具有接触抑制 性。总之，hTERT－hod－1基本上为正常细胞而无明显转化特征，保持了人 成牙本质细胞样细胞的生物学特征。 四、永生化人成牙本质细胞样细胞系的功能学特征 hTEBT－hod－1 在 mRNA水平上表达骨涎蛋白（bone sialoproteln， BSP）、DMPI 和 DSPP，在蛋白质水平上表达 1 型胶原和牙本质涎蛋白 （denim sialoprotein，DSP）。在矿化液诱导下，细胞 ALP活性升高， 骨钙素（osteocalcin，OC）分泌量增加，细胞复层生长而形成细胞结节， －4． 第四军医大学博士学位论文分泌基质并矿化。透射电子显微镜观察显示：细胞蛋白质合成分泌功能活跃，细胞外基质（extracellular matrix，ECM）见大量网状或平行排列的胶原（原）纤维和高电子密度的针状晶体沉积。细胞内和ECM中可见基质膜泡。因此，hTERT－hodl在体外培养中可以分泌牙本质细胞外基质并矿化。