胃癌严重危害人类健康,是全世界最常见的恶性肿瘤之一,其发病率和死亡率在所有肿瘤中排第四和第二位,长期以来我国一直是胃癌高发区。虽然近年来全世界范围内胃癌的发病率和死亡率趋势呈逐年下降,但全世界每年新发病例90万、有70万病人死于胃癌,其中我国就有30万人。尽管随着科学的发展,手术、放疗、一系列的化疗药物和靶向药物被广泛应用,但晚期胃癌、转移性胃癌的预后仍然较差,迄今关于胃癌的发病机制及治疗研究仍没有重大突破,因此寻找胃癌早期诊断的分子标志物以及新的潜在的治疗靶点尤为重要。胰岛素样生长因子结合蛋白7(insulin-Iike growth factor binding protein7, IGFBP7),隶属IGFBPs家族,为低亲和力IGFBPs家族的第一个成员,定位在4q12,转录全长约1100kb,5个外显子。1993年Murphy等人首次发现该基因在正常脑脊膜细胞株中的表达明显高于脑脊膜瘤细胞株,并命名为MAC25,IGFBP7基因又被称作肿瘤粘附因子(tumor derived adhesion factor,TAF)、前列腺环素刺激因子(porstacyclin-stimulating facotr, PSF)、IGFBP相关蛋白1(IGFBP-related protein1)。研究发现,IGFBP7是一种分泌型蛋白,在正常人体多种组织中包括呼吸、消化、泌尿、生殖、神经、免疫和内分泌系统都有所表达,除了脑和脊髓之外,所有内皮细胞中IGFBP7均为阳性表达,IGFBP7在组织和细胞中,表达强度和表达部位的特异性,提示着它不同的生物学功能。近年来,关于IGFBP7在肿瘤发生发展中的报道众多,但研究结果有所不同。主要体现在：前列腺癌、乳腺癌、结肠癌、肺癌、肝癌、脑膜瘤、黑色素瘤、食管癌腺癌等恶性肿瘤中存在低表达,胰腺癌、白血病及食管癌鳞癌中存在高表达,而胶质细胞瘤中降低与升高表达都有所报道。众多的研究表明,IGFBP7是与肿瘤的发生发展相关的基因,但目前IGFBP7对胃癌恶性生物学表型的影响知之甚少,IGFBP7在胃癌发生发展中究竟是发挥抑癌作用还是促癌作用也不明确,因而有必要进行深入研究探讨。本课题的目的是明确IGFBP7在人类胃癌组织中的表达情况,对胃癌细胞生物学中的作用,并探讨相关的分子机制,并对裸鼠移植瘤生长的作用。我们首先用Realtime quantitative-PCR、Western blot、IHC不同的方法分析了IGFBP7在胃癌组织中的表达情况及与临床病理资料之间的关系,发现IGFBP7在胃癌组织低表达,IGFBP7低表达的胃癌病人中,术后预后较差。随后我们在无内源性表达IGFBP7的胃癌细胞SGC-7901中转染了IGFBP7,IGFBP7表达阳性的胃癌细胞MKN-28中转染了si-IGFBP7,分别通过RT-PCR、Western blot、MTT、细胞流式分析、细胞划痕以及Transwell小室等方法,分析IGFBP7对结胃癌细胞的影响,并对IGFBP7干预后的细胞用Western blot方法检测CyclinD1, CDK4, MMP2, E-cadherin, Bcl2和Bax的表达。结果发现,在胃癌细胞中过表达IGFBP7后抑制SGC-7901细胞的生长,使G1期细胞增多,细胞划痕和Transwell小室迁移实验显示IGFBP7过表达可显著抑制胃癌细胞的迁移、侵袭能力,促进了细胞的凋亡,并且上调上皮标记物E-cadherin,凋亡标记物Bax的表达,而周期调节分子CyclinD1, CDK4,间质标记物MMP2,凋亡标记物Bcl2有不同程度的下调。在胃癌细胞MKN-28中,也观察到了相似的结果,降低IGFBP7表达后可促进细胞生长,使G1期细胞减少,促进胃癌细胞的迁移能力,抑制细胞的凋亡,并且上调周期调节分子CyclinD1、CDK4、间质标记物MMP2、凋亡标记物Bcl2,而上皮标记物E-cadherin、凋亡标记物Bax的表达有不同程度的下调。最后我们构建裸鼠模型,将单细胞悬液注射接种至裸鼠皮下,构建胃癌的裸鼠成瘤动物模型,观察对比IGFBP7是否在体内实验中对胃癌细胞的特性发生影响,发现与对照组裸鼠相比,移植瘤体注射IGFBP7对人胃癌裸鼠移植瘤的生长有抑制作用。研究目的1.研究IGFBP7在人类胃癌组织中的表达情况,分析比较其表达水平与临床病理学特征间的相关性,探讨其潜在的临床价值；2.通过体外实验探讨IGFBP7对胃癌细胞株生物学功能的作用及相关分子机制；3.通过动物实验探讨移植瘤体IGFBP7对人胃癌裸鼠移植瘤的生长作用。实验方法临床试验1.收集郑州大学第一附属医院普通外科手术切除的新鲜胃癌组织和癌旁组织；石蜡包埋胃癌及癌旁组织；2.利用实时荧光定量PCR、westernblot和免疫组织化学染色技术从mRNA水平和蛋白水平检测IGFBP7在胃癌组织和相应的癌旁组织中的表达情况,分析IGFBP7蛋白表达与胃癌临床病理因素的关系,揭示IGFBP7潜在的临床应用价值。体外实验1.利用RT-PCR、western blot技术对胃癌高分化细胞株MKN-28、中分化胃癌细胞株SGC-7901和AGS、低分化胃癌细胞株MKN-45以及永生化正常胃黏膜上皮细胞GES-1,从mRNA水平和蛋白水平检测IGFBP7在各细胞株中的表达情况,选取后续实验用的细胞株；2.将人中分化胃癌细胞系SGC-7901和高分化细胞系MKN-28细胞分别设置,(1)SGC-7901过表达组：空白对照组、阴性对照和转染PcDNA3.1-IGFBP7组；(2)MKN-28细胞敲低组：空白对照组、阴性对照和siRNA-IGFBP7组,转染48h后用RT-PCR和western blot法检测mRNA及蛋白的表达水平,检测过表达和干扰IGFBP7后的效率。3.采用MTT实验、细胞流式分析检测IGFBP7过表达和(或)干扰时对SGC-7901和MKN-28细胞体外增殖能力以及对细胞周期的影响；4.将事先分好组的细胞铺入六孔板,划痕实验,显微镜观察记录各时间点细胞向中心迁移的距离,检测细胞的迁移力。将细胞直接加入Transwell小室内孵育24h,观察细胞迁移力；加入聚碳酯膜涂有基质胶的Transwell小室内培养24h,观察细胞的侵袭。显微镜检测穿膜细胞数,计算干预组细胞相对于阴性对照组和空白对照组的迁移率和侵袭率；5.采用流式细胞术检测各组转染的的SGC-7901和MKN-28细胞在细胞凋亡方面的变化；6.应用Western blot方法检测细胞周期、细胞侵袭、细胞凋亡关键调控分子的表达变化,初步探讨IGFBP7影响细胞周期、侵袭和细胞凋亡的分子机制；动物实验1.筛选构建稳定表达IGFBP7的SGC-7901株；2.裸鼠随机分组,按照以下分组方式在裸鼠的右协肋皮下注射接种2x107个/200μl/只SGC-7901细胞,实验组(稳定表达IGFBP7 SGC-7901),对照组(SGC-7901);3.每4天称量1次裸鼠的重量和形成肿瘤的体积,根据所得数据绘出瘤体生长曲线,20天后将裸鼠处死,取出瘤体,HE法染色后观察瘤体瘤组织特征,使用IHC法检测两组肿瘤组织中IGFBP7及相关蛋白的表达。统计学分析计量资料数据以均数±标准差(x±s)表示,采用x2检验,LSD检验,Tamhane’s T2检验及t检验。采用SPSS17.0软件进行统计学分析,检验水准为P<0.05。结果1. qRT-PCR、Westernblot和IHC方法显示IGFBP7的mRNA、蛋白在新鲜胃癌组织中的表达明显低于相应的癌旁正常的胃粘膜组织,差异具有统计学意义(P<0.01)。IGFBP7的表达缺失与胃癌T分期(P=0.037)和病理分级(P=0.021)有关,Kaplan-Meier生存曲线显示,IGFBP7阴性患者术后生存较差。2.为了进一步研究IGFBP7对胃癌细胞生物学功能的影响,我们首先从mRNA水平和蛋白水平检测胃癌高分化细胞株MKN-28、中分化胃癌细胞株SGC-7901和AGS、低分化胃癌细胞株MKN-45和HGC-27以及永生化正常胃黏膜上皮细胞GES-1中,IGFBP7的表达情况,发现高分化细胞株MKN-28中比正常胃黏膜上皮细胞GES-1中IGFBP7表达降低,而SGC-7901、AGS、MKN-45、HGC-27中弱表达,或检测不到表达,与胃癌组织中的表达结果相一致；3.构建PcDNA3.1-IGFBP7、vector、空白对照组,转染SGC-7901细胞；构建siRNA-IGFBP7、consiRNA-IGFBP7、空白对照组,转染MKN-28细胞；48h小时后PCR和Western blot验证感染效率,发现PcDNA3.1-IGFBP7感染SGC-7901细胞后,与对照组相比IGFBP7的表达水平显著增加,而siRNA-IGFBP7感染MKN-28细胞后,与对照组相比IGFBP7的表达水平明显下降。4.MTT实验显示,PcDNA3.1-IGFBP7感染SGC-7901细胞后,其生长速度明显慢于vector感染的SGC-7901细胞(P<0.05)；反之,与siRNA-IGFBP7感染的MKN-28细胞细胞相比,consiRNA-IGFBP7感染的MKN-28细胞增殖速度明显增加(P<0.05)。5.流式细胞检测显示,分别与各自与阴性对照组相比,PcDNA3.1-IGFBP7组细胞的G1期细胞比例增加(P<0.05);细胞增殖指数PI降低(P<0.05); siRNA-IGFBP7组细胞的G1期细胞比例减少(P<0.05)。6.细胞划痕实验和Transwell检测显示,PcDNA3.1-IGFBP7组的SGC-7901细胞迁移细胞的距离、数目和侵袭细胞数均减少(P均<0.05),siRNA-IGFBP7组MKN-28细胞的迁移细胞的距离、数目和侵袭细胞数相对与阴性对照组相比均增加(P均<0.05)。7. IGFBP7促进胃癌细胞发生凋亡与抵抗凋亡是肿瘤细胞的另一重要特征,因此我们利用流式细胞术检测了IGFBP7对SGC-7901和MKN-28细胞凋亡的影响,发现PcDNA3.1-IGFBP7组细胞凋亡明显增多,siRNA-IGFBP7组细胞凋亡明显减少。8.为了进一步探讨IGFBP7对细胞周期进展的影响,影响细胞侵袭、凋亡可能的分子机制,我们检测了细胞周期关键调控分子Cyclin D1和CDK4,细胞转移相关分子MMP2和E-cadherin,细胞凋亡关键调控分子Bcl2和Bax的表达变化。Western-Blot结果提示,上调IGFBP7的表达可以抑制Cyclin D1、CDK4、 MMP2、Bcl2表达,增加E-cadherin和Bax表达；反之,下调IGFBP7的表达可以促进Cyclin D1、CDK4、MMP2、Bcl2表达,使E-cadherin和Bax表达减少。9.裸鼠成瘤实验显示,两组裸鼠体质量无明显差异(P>0.05),与普通对照组相比,转染PcDNA3.1-IGFBP7组的肿瘤瘤体体积明显减小(P<0.05),抑瘤率为25.53%,免疫组化结果发现,转染PcDNA3.1-IGFBP7组的裸鼠移植瘤中IGFBP7蛋白表达水平均高于普通对照组并使Cyclin D1和MMP2下降,Bax表达增加(P均<0.001)。结论1.我们的研究发现IGFBP7在人类胃癌组织中的表达明显较低,表达降低提示手术预后较差。2.上调IGFBP7的表达能抑制胃癌细胞的增殖、迁移、侵袭,阻滞细胞周期于G1期,并能促进细胞凋亡；下调IGFBP7的表达能促进胃癌细胞的增殖、迁移、侵袭,使细胞G1期减少,抑制细胞的凋亡；其机制可能影响了Cyclin D1、 CDK4、MMP2、E-cadherin, Bcl-2和Bax这些有关细胞周期,细胞侵袭和细胞凋亡关键调节蛋白的表达相关。3. PcDNA3.1-IGFBP7可抑制人胃癌裸鼠移植瘤的生长,提示IGFBP7基因参与抑制胃癌细胞增殖。4.我们研究证实了IGFBP7基因在胃癌组织中低表达,体内及体外研究都提示IGFBP7在胃癌的发生发展中可能扮演抑癌基因的角色,进而为IGFBP7激动剂的临床应用提供了潜在的理论依据。