一、背景及目的目前在世界范围内,尤其是欧美国家,结直肠癌(Colorectal cancer,CRC)的发病率仍居高不下,排在恶性肿瘤的第三位,在恶性肿瘤所致死亡事件中亦排名第三位,而在中国恶性肿瘤发病的疾病谱中,CRC同样位列第三位。CRC主要发生在50岁以上的人群,但近年来,CRC在青少年和45岁以下成年人中的发病率呈上升趋势,且这类人群更有可能出现进展期肿瘤。近几十年来,包括CRC在内的多种恶性肿瘤已被广泛而深入的研究,得益于筛查手段、外科手术、靶向治疗及免疫治疗的普及和发展,CRC的生存率已经有较大改善。然而,目前在结直肠癌诊断及预后中仍缺乏敏感性和特异性均佳的生物标志物,现有的治疗方法还不足以预防或显著减少CRC的死亡人数,其5年生存率仍然很低。因此,为了寻找更加有效的生物标志物和综合治疗方法,进一步探索结直肠癌发生、进展及转移的分子机制是很有必要,也是最关键的。最近几年,随着基因测序技术的广泛发展,原本认为是“垃圾RNA”的长链非编码RNA(lncRNA)被证明具有重要的生物学作用。研究认为,LncRNAs可通过以下途径调控基因的表达:(1)表观遗传水平上,即启动、调控染色质重塑,组蛋白修饰(如甲基化、乙酰化等)或DNA胞嘧啶C-5位甲基化;(2)转录水平上,通过与基因5’端非编码区转录因子、增强子或启动子结合发挥作用;(3)转录后水平,通过选择性剪接、转运和转化pre-mRNA,或通过与microRNAs相互作用。目前已发现,lncRNAs对基因组的调控作用在恶性肿瘤的多种生物学过程中均有体现,例如细胞的增殖与焦亡、粘附与侵袭,以及糖代谢重编程等。LncARSR是一种新近发现的lncRNA,研究发现,它可通过调控miRNA或介导相关信号通路影响肝细胞内胆固醇合成、酒精性脂肪肝病的进展与肿瘤细胞的耐药。也有研究认为,lncARSR是一种致癌基因,在多种恶性肿瘤,如膀胱癌、肝癌和卵巢癌的发病过程中扮演重要角色。然而lncARSR在CRC发生、转移过程中的作用及分子机制尚未见报道。因此,本课题的研究目的是探讨lncARSR在CRC组织中的表达,明确与临床病理特征的相关性,同时研究其对CRC细胞迁移和侵袭能力的影响及相关机制,为临床上寻找CRC预后生物标志物及联合治疗靶点提供一定的理论基础,为CRC患者的个性化治疗提供重要参考。二、研究方法1.选取89例CRC患者结直肠癌切除组织标本,采取实时荧光定量PCR法检测组织中lncARSR的表达情况,分析其表达与患者临床指标、病理结果和患者预后间的关系。2.应用实时荧光定量PCR检测lncARSR在人类正常肠粘膜细胞株和结直肠癌细胞株SW480、SW620、HCT-8、HT29、Caco-2和RKO中的表达。3.构建高/低表达lncARSR的CRC细胞株,Transwell小室法检测lncARSR对细胞侵袭和迁移能力的影响。4.通过葡萄糖消耗、乳酸生成实验及ATP生物荧光检测分析检验lncARSR对CRC细胞糖酵解过程的影响。5.通过裸鼠尾静脉注射CRC细胞肝转移实验分析lncARSR表达对CRC细胞肝转移的影响。6.运用生信分析预测lncARSR与HK1 mRNA序列存在的miR-34a-5p结合位点,然后选用荧光素酶报告实验、RNA结合蛋白免疫沉淀实验、实时荧光定量PCR及蛋白质免疫印迹等方法检验miR-34a-5p分别与lncARSR及HK1 mRNA之间的作用关系。7.利用荧光素酶报告实验进一步确定lncARSR、miRNA及HK1三者之间的作用关系,并在临床样本中验证。8.利用Rescue方法,证明miR-34a-5p介导了 lncARSR在体外促进CRC细胞的迁移、侵袭及糖代谢重编程,以及增强CRC细胞在裸鼠体内肝转移。9.通过Kaplan-Meier分析和log rank检验lncARSR和HK1表达水平对89例CRC患者总体生存期和无病生存期的影响。三、结果1.LncARSR在CRC患者切除组织中的表达水平及临床意义(1)对89例结直肠癌患者组织中LncARSR表达进行分析,结果显示癌旁正常肠粘膜组织中LncARSR相对表达水平低于对应结直肠癌组织。LncARSR在分期较早患者(1/2期)组织内的表达量低于病理分期较晚患者(3/4期)。在结直肠癌术后复发的患者中,原发癌组织中LncARSR表达水平高于术后未出现复发的患者。(2)LncARSR表达水平与结直肠癌AJCC分期、PET/CT SUVmax值以及淋巴结、远处转移有显著相关性,而与患者的其他临床指标无显著相关性。(3)生存分析显示,LncARSR在癌组织中高表达的患者累积存活率较低,无病生存期较短。在术后出现复发患者中,LncARSR在癌组织中高表达的患者总生存期低于癌组织中LncARSR较低表达的患者;而在术后未出现复发患者中,癌组织中LncARSR高表达的患者总生存期与癌组织中LncARSR较低表达的患者总生存期比较无显著差异。2.LncARSR对结直肠癌细胞生物学特性的影响(1)为了探讨在体外lncARSR促进CRC转移的具体作用机制,我们用RT-PCR检测了 6个CRC细胞系和1个正常结肠上皮细胞系中lncARSR的表达情况。结果显示,与正常细胞相比,CRC细胞系普遍表达高水平的lncARSR。在6种人结直肠癌细胞株中,Caco-2细胞株lncARSR相对表达水平最低,而HCT-8相对表达水平最高,我们选择这两个细胞株应用于后续实验。(2)我们构建了稳定过表达lncARSR的Caco-2细胞系和稳定敲除lncARSR的HCT-8细胞系。Transwell检测结果显示,在Caco-2细胞中过表达lncARSR,发生侵袭和迁移的细胞数显著升高;同时在HCT-8细胞中抑制lncARSR的表达,则发生侵袭和迁移的细胞数则显著减少。(3)我们进一步分析lncARSR是否调节CRC细胞的糖代谢水平。lncARSR过表达或下调后,培养基中细胞葡萄糖摄取水平和乳酸生成水平分别显著升高或降低。我们还检测了CRC细胞内ATP生成水平。我们发现lncARSR过表达的Caco-2细胞与对照组相比,ATP水平升高。相反,lncARSR敲除后,HCT-8细胞ATP水平下降。(4)众所周知,肝转移在CRC患者最常见的远隔转移。那么接下来我们进行体内试验,探索lncARSR失调是否可影响CRC细胞肝脏转移,我们将lncARSR过表达的Caco-2细胞和lncARSR沉默的HCT-8细胞及其对照注入裸鼠尾静脉。使用HE染色计数每只小鼠的肝转移灶数目。我们发现,与对照组相比,过表达或敲除lncARSR可在小鼠肝脏中发现更多或更少的转移灶。3.LncARSR对结直肠癌细胞作用分子机制研究(1)我们利用Starbase2.0数据库与生物信息数据库TargetScan,发现miR-34a-5p分别与lncARSR及HK1 mRNA之间存在互补的碱基对,提示lncARSR可能发挥ceRNA作用,靶向结合miR-34a-5p,促进其降解,进而调控下游HK1的表达,而HK1可催化加速细胞内的糖酵解进程。Western blot检测结果显示,lncARSR过表达显著促进HK1的表达,而通过转染miR-34a-5p mimics可以减弱HK1的表达。相反,lncARSR敲除可以抑制HK1的表达,而紧接着抑制miR-34a-5p则可以消除该影响。接着我们利用抗AG02-RIP实验发现过表达lncARSR降低了 HK1的富集,而敲除lncARSR则增加了 HK1的富集。随后,我们构建了针对miR-34a-5p结合位点的野生型和突变型的含有MS2结合位点的lncARSR质粒。CRC细胞共转染上述野生型或突变型lncARSR质粒和MS2结合蛋白及GFP。抗GFP-RNA免疫沉淀实验表明,miR-34a-5p仅在野生型lncARSR中富集,而突变型lncARSR对miR-34a-5p的富集与MS2对照无显著性差异。进而,我们构建含有miR-34a-5p结合位点野生型或突变型lncARSR的荧光素酶报告基因,并与miR-34a-5p模拟物、抑制剂或其阴性对照共转染至CRC细胞。我们发现miR-34a-5p inhibitor可以增加野生型lncARSR的荧光素酶活性,但对突变型lncARSR没有影响。相反,miR-34a-5p模拟物可降低野生型lncARSR的荧光素酶活性,而对突变型lncARSR则无影响。RT-PCR检测证实miR-34a-5p敲除或过表达分别上调或下调了 HK1 mRNA的表达。接着我们构建HK1 3’UTR上针对miR-34a-5p结合位点野生型或突变型的荧光素酶报告基因,并与miR-34a-5p模拟物、抑制剂或阴性对照共转染CRC细胞。miR-34a-5p抑制剂或模拟物可增强或降低野生型(而非突变型)HK1 3’ UTR的荧光素酶活性。此外,lncARSR过表达增加的荧光素酶活性可被miR-34a-5p模拟物部分减弱。相反,lncARSR敲除所降低的荧光素酶活性可被miR-34a-5p inhibitor部分逆转。此外,我们进一步分析了89例CRC患者lncARSR与HK1 mRNA的相关性,发现HK1 mRNA的表达与lncARSR的表达呈正相关。综上,我们证实lncARSR在细胞质内可发挥ceRNA作用,吸附miR-34a-5p,进一步调节HK1的表达。(2)我们进一步进行了体外和体内的补救分析实验。Transwell实验显示,miR-34a-5p模拟物可以降低lncARSR过表达在Caco-2细胞中引起的迁移和侵袭的增强影响。相反,miR-34a-5p抑制剂可以解除lncARSR下调对HCT-8细胞迁移和侵袭的抑制。接下来,我们验证miR-34a-5p是否影响CRC细胞中的葡萄糖代谢。结果发现,miR-34a-5p模拟物可降低lncARSR上调诱导的Caco-2细胞对培养基中葡萄糖的摄取和乳酸产生水平;而miR-34a-5p抑制剂可以消除lncARSR下调对HCT-8细胞葡萄糖摄取和乳酸产生的抑制作用。此外,通过分别转染miR-34a-5p模拟物或抑制剂,lncARSR过表达或敲除引起的ATP水平上调或下调也可以部分逆转。更重要的是,进一步的体内实验表明,转染miR-34a-5p模拟物或抑制剂可以部分削弱过表达或敲除lncARSR在小鼠肝脏中产生的更多或更少的转移性癌灶。因此,上述结果表明lncARSR通过竞争性结合miR-34a-5p促进CRC细胞的转移和糖代谢重编程。(3)通过生存分析验证基于lncARSR和HK1表达水平进行分组患者的总体生存期和无病生存期,发现lncARSR和HK1 mRNA表达量高的患者的总体生存期和无病生存期较其他CRC患者差。这说明,lncARSR-HK1协同高表达可用于预测肿瘤复发或转移,此类CRC患者生存率更低。四、结论1.LncARSR在结直肠癌组织中表达升高,且与临床、病理特征及术后生存期相关。2.LncARSR在细胞质内可发挥ceRNA作用,吸附miR-34a-5p,进一步调节HK1的表达,促进结直肠癌细胞糖酵解,从而增强结直肠癌细胞肝转移。3.LncARSR可能成为结直肠癌新的预后标志物和分子治疗靶标。