【摘 要】
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目的:研究C9orf72对肌萎缩性侧索硬化症(ALS)相关蛋白DNA结合蛋白-43(TDP-43)及融合肉瘤蛋白(FUS)的调控作用。方法:将带有目的基因的质粒载体(C9orf72基因相关的蛋白、TDP-4
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目的:研究C9orf72对肌萎缩性侧索硬化症(ALS)相关蛋白DNA结合蛋白-43(TDP-43)及融合肉瘤蛋白(FUS)的调控作用。方法:将带有目的基因的质粒载体(C9orf72基因相关的蛋白、TDP-43、FUS等的质粒)与感受态细胞(DH-5α感受态大肠杆菌)混合,进行细菌转化;将含有相应质粒的大肠杆菌接种培养;用Sanprep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒抽提质粒,得到不同的质粒,-20℃保存备用;用HEK293细胞(人胚胎肾上皮细胞)进行相应质粒的细胞转染;用Western blotting法检测TDP-43、FUS等蛋白表达;用免疫共沉淀法及免疫荧光法检测C9orf72基因相关的蛋白、TDP-43、FUS的定位及聚集情况。结果:在本实验中,我们发现两个FUS突变体比野生型容易在细胞质形成聚集,突变体的细胞质分布均匀,加Arsenite诱导后形成明显聚集。TDP-43蛋白加Arsenite诱导后会向细胞质转运,但不似FUS容易形成聚集物。在正常情况下,Poly-GA/GP/PA会促使TDP-43向细胞质转运,而Poly-GR/PR不具备这种效应。在Arsenite的压力诱导条件下,Poly-GR/PR会破坏TDP-43的胞质转运。Poly-GR/PR与FUS突变体共转染后,可以使FUS在Arsenite的压力条件下形成的蛋白颗粒解聚。结论:FUS以及TDP-43的核质转运异常以及蛋白聚集是ALS病理过程中的经典现象,本课题的研究表明Poly-GR/PR可以显著调节FUS以及TDP-43的核质转运以及蛋白聚集,提示C9orf72异常编码的重复蛋白可以与FUS/TDP-43共同作用在同一个信号通路之中。
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