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杆状病毒以其特有的双相复制周期与两种结构与功能不同的病毒粒子类型而区别于其他病毒。为了研究p74在杆状病毒初级感染过程中的作用及其作用机理，采用经典同源重组方法构建了2种p74缺陷型病毒。以同源重组的方式将由多角体启动子驱动的gfP表达盒分别重组到AcMNPV与HaSNPV基因组的p74 ORF位相，从而分别获得两种p74插入失活的重组病毒rAc-gfpΔp74和rHa-gfpΔp74，为下一步研究p74基因的功能打下基础。阳性重组病毒通过空斑纯化，GFP的表达，PCR扩增以及DNA测序来进行筛选与鉴定。所获得的阳性重组病毒通过注射感染能够在宿主细胞和幼虫内表达GFP，甚至在日光下就可以判定重组病毒的感染性，为研究和分析重组病毒的感染过程及机制带来了很大的方便。 为了进一步研究p74的功能，使用Bac-to-Bac系统构建了2个多角体阳性且p74超表达的两种重组病毒rAc-p74++polh+和rHa-p74++polh+。两种重组病毒rAc-p74++polh+和rHa-p74++polh+分别感染其敏感细胞Sf9和Hz-AM1，被感染宿主细胞中均产生包涵体，说明多角体基因已经成功地转座到Bacmid和Hanpvid中并得到高效率表达。而将感染后的细胞裂解物进行SDS-PAGE电泳，结果发现两种重组病毒感染的宿主细胞均出现2条特异性的带，一条为74 kD左右的P74蛋白带，另一条为30 kD左右的多角体蛋白带。将重组病毒感染的细胞蛋白用Ni++-NTA树脂进行纯化，结果获得纯化的带组氨酸标签的重组P74蛋白，经SDS-PAGE检测到单—74 kD的蛋白带，同时Western blot分析结果表明所纯化的74KD蛋白与抗组氨酸标签的单克隆抗体发生特异性结合，这表明所构建的重组病毒成功的使带组氨酸标签的P74蛋白在宿主细胞内得到了高表达。因此，成功获得了2种既能在宿主细胞中超表达P74蛋白又具有可供口服感染的包涵体形式的重组病母。 比较p74一失活型病毒（包括rAC一gfp△p74和rHa一gfp△p74），p74“双拷贝病毒（即rAe一p74“polh‘和rHa一p74++ polh‘）、以及p74+野生型病毒（包括wtAeMNPV与wtHaSNPV）这3类病毒的生长曲线，发现这3种病毒的一步生长曲线极其相似，并没有出现显著差异。说明无论是p74基因的失活，还是p74基因的超表达，都几乎不影响BV装配和形成，也不影响BV的产量和增殖。进一步研究发现p74一失活型病毒，p74++双拷贝病毒、以及p74+野生型病毒所产生的病毒包涵体的产量之间没有显著的差异。将纯化的包涵体病毒在电子显微镜下进行观察，发现3类病毒形成的包涵体之间在大小，形状方面基本相似，也没有明显的区别或者差异。这说明了p74的缺失、超表达对包涵体病毒的形状、大小、产量几乎没有什么影口向。 但是3类病毒包涵体感染宿主幼虫的生物测定结果表明，p74一重组病毒包涵体失去了对敏感宿主幼虫的感染力。而p74++双拷贝病毒对宿主幼虫的感染率和p74十野生型病毒对宿主幼虫的感染率十分接近。以上结果充分说明了P74蛋白的超表达不影响病毒包涵体的毒力和感染力。但是p74基因的缺失却导致了感染力的丧失，这说明p74是NPV包涵体病毒感染宿主的必要因子，在病毒侵入宿主中肠过程中起到十分关键的作用。而使用野生型病毒和p74缺陷型病毒共感染宿主昆虫时，幼虫被有效地感染并发出绿色荧光。这说明在野生型病毒的拯救下，P74缺陷型病毒突破了宿主中肠的防御而有效感染了宿主幼虫。 由于野生型病毒能拯救p74缺陷型重组病毒包涵体对宿主幼虫的感染力，提示着P74蛋白在毒力拯救过程中发挥了功能，所以有必要使用纯化的P74蛋白进行确证。将两种重组病毒rAc一p74++polh+和rHa一p74++ polh+分别感染Sfg细胞和Hz一AMI细胞。收集感染后48和72小时的细胞进行SDS一PAGE分析和Western Blot分析，结果表明被感染细胞高效表达了带有HIS一tag（组氨酸标签）的重组P74蛋白。并用Ni++一NTA亲和树脂纯化该重组蛋白，结果成功地获得纯化的带有组氨酸标签的融合P74蛋白。 将纯化的P74蛋白与同种的p74缺陷型重组病毒包涵体一起喂食敏感宿主幼虫，结果发现由于P74蛋白的存在，使得p74缺陷型病毒恢复了对敏感宿主幼虫的感染力，由于GFP的表达，被感染幼虫在3天后虫体变成绿色，最终液化死亡。并且这种拯救是一种可饱和的方式。AcMNPV一P74蛋白只能拯救同种的p74一AcMNPV的口服感染力，而不能拯救p74书aSNPV，反之HaSNPV一P74蛋白也只能拯救同种p741aSNPV而无法拯救p74认cMNPV的口服感染力。这说明一种P74蛋白只能拯救自身p74缺陷病毒的感染力而不能拯救异源p74缺陷病毒，因此P74蛋白和宿主的相互作用具有种属特异性，很可能和病毒的宿主范围有一定的关系。 用HaSNPV一Bacmid（Hanpvid）构建了高表达P74一GFP融合蛋白的重组病毒rHa一p74gfp。用该重组病毒感染Hz一AMI细胞，在病毒接种后24小时、36小时、48小时、72小时取样，直接在激光扫描共聚焦显微镜下观察被感染细胞的形态以及细胞中绿色荧光分布情况。rHa一p74gfP感染后24小时，绿色荧光主要出现在细胞质中，说明绿色的P74一GFP融合蛋白大部分集中在胞质中。感染后36小时，绿色荧光只要在细胞核中被观察到，表明绿色融合蛋白主要集中?