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目的:构建负载万古霉素(VAN)/聚乳酸-羟基乙酸(PLGA)微球的β-磷酸三钙(TCP)骨组织复合支架,并对此支架的表征、药物释放、力学性能、生物相容性和体外抑菌性能进行研究。建立一种局部感染性骨缺损的兔胫骨慢性骨髓炎模型,植入复合支架,观察支架在动物体内抑菌及诱导骨再生效果。目的是制备出能有效控制感染和修复骨缺损的骨组织工程支架,最终能为应用于临床提供理论和实验支持。实验方法:本实验由四部分组成1、正交设计优化VAN/PLGA微球的制备及体外药物释放研究用复乳溶剂挥发法,以微球的载药率和包封率为主要考察指标,以100μm的粒径为基准,对不同的PLGA溶液浓度、内水相药物浓度、外水相PVA浓度、搅拌转速四个工艺条件进行四因素三水平的正交实验。对优化后微球的表征、体外药物释放及抑菌作用进行测定研究。2、3D打印多孔β-TCP支架负载VAN/PLGA微球复合支架的构建及体外实验研究用CAD制图软件设计β-TCP支架立体模型,结合3D打印技术打印出多孔β-TCP支架,用壳聚糖(CTS)将支架包被使其带有正电荷,利用静电吸附的作用将带有负电荷的VAN/PLGA缓释微球负载于支架上,再次用CTS将微球和支架包裹。对此复合支架的表征、力学性能、生物相容性、体外药物缓释性能及抑菌性能进行测定研究。3、两种不同类型兔胫骨骨髓炎模型的制备用两种方式制备不同类型的兔胫骨骨髓炎模型并进行比较。方法:将新西兰大白兔45只,随机分为5组:小孔对照组(A1)、小孔实验组(A2)、大孔对照组(B1)、大孔实验组(B2)、空白组;除空白组5只,其余每组10只。A组采用小孔法,用1mm钻头在兔胫骨中上段钻孔,A1组经孔注入100μl生理盐水,A2组注入金黄色葡萄球菌(SA)(2×10~6cfu)悬浮液100μl;B组采用大孔法,用5mm钻头在兔胫骨中上段钻孔,孔洞局部用大青叶生物纸填塞,B1组注入100μl生理盐水,B2组注入SA(2×10~6cfu)悬浮液100μl;A、B组在注入盐水或菌液后均用骨蜡进行封闭,并关闭切口;空白组未做任何处理。在术后30d内,严密监测左后肢伤口外观和感染的一般体征,测量体温,从实验动物耳缘静脉采集血液分析C反应蛋白水平(CRP),降钙素原水平(PCT)变化;于14d及28d时进行X线、CT影像学及组织学观察。4、β-TCP负载VAN/PLGA微球治疗感染性骨缺损的动物实验研究实验目的为治疗感染性骨缺损,依据第三部分实验得出的结果,选用大孔法在30只兔胫骨中上段植入SA10~6cfu,4周后通过X线检查选取得到符合下一步实验的动物28只。分以下四组:清创组(A)、清创微球实验组(B)、清创空白支架实验组(C)、清创复合支架实验组(D),每组各6只,另设5只空白对照组。于术后1月、4月时通过X线、CT、Micro CT、组织病理学观察材料的局部抑菌和成骨能力。结果:1、正交设计优化VAN/PLGA微球的制备及体外药物释放研究最佳工艺条件为油相9ml:PLGA500mg、内水相1ml:VAN300mg、外水相:PVA溶液浓度为3%、转速:1200r/min。优化后方案制备出微球:载药率为(17.40±1.87)%;包封率为(35.12±3.65)%,平均粒径为(102±37)μm。微球在第1d药物释放率为(17.91±2.41)%,有一定突释;2d后释药率逐渐降低放缓,12d时累计释放(58.78±1.54)%,12d至24d平均每d释放1.41%,于24d时累计释放(75.31±1.02)%。2、3D打印多孔β-TCP支架负载VAN/PLGA微球复合支架的构建及体外实验研究经测定,空白支架体积为6mm×6mm×5mm,400μm小梁,500μm孔径,空白支架实际孔隙率为(48.8±1.21)%;(离心法)复合支架(TCCS)孔隙率为(25.46±2.45)%;(静电吸附壳聚糖包被法)复合支架(EACS)孔隙率为(21.19±0.79)%。用万能材料力学机测得EACS最大承载力为221.5N±9.7N,支撑强度约6MPa(远高于松质骨压缩最低强度2MPa);体外与骨髓间充质干细胞(BMSCs)共培养结果显示,实验中涉及的空白支架、微球、壳聚糖这三种材料均对BMSCs的增殖无明显影响,这三种支架上附着的细胞均随时间的延长而数量增多;支架的体外释药及抑菌实验均表明:24d时负载VAN/PLGA微球的β-TCP骨组织支架仍有良好的释药率和抑菌作用。3、两种不同类型兔胫骨骨髓炎模型的制备30d后空白组及对照组(A1、B1)存活率100%,A2组存活率70%,B2组存活率100%。术后实验组A2、B2兔体温和C反应蛋白指标均呈现不同程度升高,A2组较B2组升高明显,降钙素原数值轻微降低。钼靶X线检查:术后14、28d时,A2组阳性率72%、100%,B2组阳性率89%、100%;CT检查:术后14d,A2、B2组阳性率均为100%,A2组影像学表现为急性血源性骨髓炎,B2组表现为局部骨感染征象;28d时A2组表现为骨硬化性骨髓炎,B2组影像学表现为局部骨脓肿改变。病理表现:术后30d,A2、B2组视野范围内均可见中性粒细胞浸润,骨膜增厚,骨皮质和骨小梁破坏及增生,骨组织结构完整性丧失。30d取A2、B2组已处死兔子胫骨局部脓液和坏死骨组织进行研磨后培养金葡菌均呈阳性,空白组及对照组均表现为阴性。4、β-TCP负载VAN/PLGA缓释微球治疗感染性骨缺损的体内实验研究利用大孔法制备的局部骨脓肿型骨髓炎模型,通过术后1月、4月的时间点,用钼靶X线、CT、Micro CT、病理切片等手段观察,结果表明,术后单纯清创组再次感染,医治感染性骨缺损时单纯的清创无法彻底根除细菌;清创微球组虽然一定程度上控制了感染,但骨缺损修复以纤维瘢痕为主,骨再生速度慢;单纯支架组由于支架无抗感染能力,虽然诱导了骨的增生,但最终因为感染的未控制而骨愈合欠佳;只有负载VAN微球的支架组得到了良好的实验结果,控制感染的同时积极诱导了骨的再生。在Micro CT材料重建和病理结果中观察到了新骨的产生,显示骨组织是以材料为中心,在支架表面增生形成新生骨。结论:采用最佳工艺可稳定制备出100μm左右粒径均匀释药平稳的VAN/PLGA缓释微球;大孔法可制备出局部骨脓肿型骨髓炎模型;β-TCP负载VAN/PLGA微球复合支架可应用于兔局部感染性骨缺损的治疗;材料植入以后,能够在感染性骨缺损的局部立体空间内,全方位、长时间地释放所包封的VAN,达到在病灶内控制感染的目的;同时还可以起到填充骨缺损,诱导成骨,加快骨组织的重建。本研究结果对骨髓炎的病理机制有了更深入的了解,对将来临床治疗骨髓炎时植入缓释抗生素材料提供理论和实验支持。