论文部分内容阅读
目的:膀胱癌肿瘤细胞的失控生长是膀胱癌高复发及高致死率的主要原因,研究导致膀胱发生癌变的分子机制,对能够有效干预恶性增殖的靶点进行鉴定,并发现有效治疗膀胱肿瘤的小分子药物,已成为膀胱肿瘤治疗方面的重要问题。冬凌草甲素(Oridonin,ORI)在体内以多靶点、多通路形式调节细胞的各项功能。为深入理解Oridonin的抗肿瘤分子机制,并为其在膀胱肿瘤治疗的有效应用上提供指引,本研究拟从系统层次上对冬凌草甲素的直接作用靶点进行搜寻,从而在根本上对Oridonin的抗肿瘤原理进行深层次的探索与理解。研究方法:1.通过人类蛋白质组芯片检测以及应用生物信息学分析,鉴定可能与药物Oridonin直接结合的潜在靶基因。2.通过小分子pull-down实验体内验证Oridonin与己糖激酶1(HK1)的结合。3.通过免疫印迹(Western Blotting)分别检测HK1在膀胱癌组织中的表达和在其他正常组织中的表达,并进行比对分析。采用HPA数据库评估HK1表达与肿瘤分级之间的关系,采用TCGA数据库结合基因集富集分析方法,对HK1在膀胱癌恶性发生发展过程中可能存在的癌生物学功能进行探索。4.在膀胱癌细胞系5637、UMUC3中结合HKL1基因敲减实验和CCK8、5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷方法,检测HK1敲减对膀胱癌细胞的分裂、存活能力的影响。5.利用膀胱癌细胞系5637、UMUC3,结合HK1的基因敲减,通过基因敲减、CCK8、Western Blotting实验研究Oridonin对膀胱癌细胞存活能力及HK1表达的影响。6.利用Octet K2分子互作考察HK1与Oridonin之间的结合情况。结果:1.利用蛋白质组芯片技术,结合生物信息分析和结合验证,初步发现了包括HK1在内大量的Oridonin潜在直接结合蛋白。本研究发现一种蛋白质(HK1),它在与冬凌草甲素相互作用的过程中不仅参与了糖酵解的过程,还与多种重要的细胞信号通路发生了反应。2.Oridonin与己糖激酶1(HK1)的体内结合被初步证实。3.HK1蛋白在膀胱癌变组织细胞中的表达,远远高于HK1蛋白在健康膀胱组织细胞中的表达水平;同时HK1蛋白在高级别膀胱癌变组织细胞中的表达水平也远远高于HK1蛋白在低级别膀胱癌组织细胞内的表达水平;以上事实说明在膀胱癌标本中,HK1蛋白的高表达影响着细胞代谢、细胞增值和细胞凋亡。4.在细胞内敲减HK1基因,即可有效降低膀胱癌细胞分裂增殖能力和存活能力,进而说明HK1在膀胱癌中具有癌基因作用。5.Oridonin对于膀胱癌细胞具有很强的细胞毒性,并且通过抑制HK1的表达,能够有效抑制膀胱癌细胞增殖。6.分子间相互作用的结果提示,HK1与不同浓度Oridonin间均具有结合和解离作用且结合呈浓度依赖性趋势。结论:抗癌小分子药物Oridonin可与HK1等涉及信号调节的功能蛋白直接结合。在人体膀胱癌变组织中,抑制HK1蛋白的表达能力可以有力遏制癌细胞的分裂增殖能力,并有效缩短癌细胞寿命,进而说明HK1在膀胱癌中具有癌基因作用。Oridonin直接结合HK1,达到遏制HK1蛋白表达的目的,从而在根本上控制癌细胞的分裂增值,降低其存活能力,最终使细胞毒性作用有效发挥。