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研究目的缺乏有效的分子靶点和治疗药物是肝细胞肝癌(以下简称肝癌)死亡率居高不下的重要原因。近年来研究发现YAP(Yes-associated Protein,YAP)及其同源蛋白TAZ(transcriptional coactivator with PDZ-binding motif,TAZ)的异常激活在肝癌发生发展中发挥关键作用,但一直缺乏有效的干预手段。其根本原因在于YAP/TAZ作为转录调控蛋白,难以用小分子化合物进行直接靶向干预,“可药靶性”不高。因此,亟需寻找调控YAP/TAZ异常激活的上游“可药靶”蛋白,为肝癌治疗提供新靶点和新策略。去泛素化酶(Deubiquitinating enzymes,DUBs)通过调控底物蛋白的泛素化修饰,可稳定蛋白的水平及功能,且去泛素化酶的催化位点和活性口袋比较明确,是非常理想的药物作用靶点。本研究前期通过筛选,发现去泛素化酶USP10(Ubiquitin-specific peptidase 10,USP10)可有效调控YAP/TAZ的蛋白丰度及其转录活性。因此,本课题将深入研究USP10去泛素化酶调控YAP/TAZ蛋白的作用方式及分子机制,明确USP10在肝癌异常增殖中的关键作用,从而为肝癌治疗提供全新靶点。研究方法:(1)筛选发现调控YAP/TAZ的去泛素化酶:采用DUBs si RNA库对YAP/TAZ的转录活性和蛋白稳定性进行双荧光素报告基因系统筛选,寻找影响YAP/TAZ活性的去泛素化酶;采用Western Blotting考察去泛素化酶USP10对YAP/TAZ蛋白水平的影响;采用q RT-PCR考察USP10对YAP/TAZ的m RNA水平的影响;(2)研究USP10调控YAP/TAZ的分子机制:采用Western Blotting考察USP10酶活功能对YAP/TAZ蛋白水平的影响;采用Western Blotting和蛋白酶体抑制剂MG132考察USP10调控YAP/TAZ是否依赖于泛素-蛋白酶体信号通路;采用免疫沉淀技术和Western Blotting考察USP10与YAP/TAZ的结合作用;采用体内外去泛素化实验和免疫沉淀技术考察USP10对YAP/TAZ蛋白上的泛素链的影响。(3)USP10通过稳定YAP/TAZ的蛋白水平促进肝癌细胞体内外增殖:体外肝癌细胞增殖抑制实验考察USP10通过调控YAP/TAZ对多株肝癌细胞增殖的影响;体外克隆形成实验考察USP10对多株肝癌细胞克隆形成的影响;采用体内细胞移植瘤和肝癌患者来源的移植瘤模型(Patient-derived Xenografted,PDX)考察USP10促进肝癌增殖的作用;(4)DEN诱导原发性肝癌发生和临床肝癌样本考察USP10-YAP/TAZ信号轴在肝癌发生发展中的作用研究:采用免疫组化考察临床肝癌病人组织芯片中USP10、YAP和TAZ蛋白的表达水平及其相关性;采用二乙基亚硝胺(N-Nitrosodiethylamine,DEN)造模诱导小鼠肝癌的发生比较肝脏肿瘤区域和正常组织中的表达水平;采用癌症基因图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)来源的Ualcan、Kaplan Meier和GEPIA等多种临床数据库考察USP10-YAP/TAZ信号轴在临床肝癌发生发展中是否被高度激活,同时分析USP10表达水平与肝癌患者预后的相关性。研究结果:(1)筛选发现调控YAP/TAZ的去泛素化酶:通过DUBs si RNA文库筛选,我们发现在98个DUBs中,USP10敲低下调YAP/TAZ的转录活性和蛋白水平效果最为显著;进一步在不同肝癌细胞株上敲低或过表达USP10可影响YAP/TAZ的蛋白水平,而对YAP/TAZ的m RNA水平无影响。(2)研究USP10调控YAP/TAZ的分子机制:USP10调控YAP/TAZ的蛋白水平依赖于其去泛素化酶活功能;敲低USP10可诱导YAP/TAZ发生泛素-蛋白酶体的降解;蛋白结合实验说明USP10与YAP/TAZ存在结合,证明USP10直接作用于YAP/TAZ;体内外去泛素化酶实验说明USP10直接作用于YAP/TAZ,进而移除YAP/TAZ上的泛素链。(3)USP10通过稳定YAP/TAZ的蛋白水平促进肝癌细胞体内外增殖:体外多株肝癌细胞实验证明敲低USP10可显著抑制细胞的增殖及克隆形成能力;体内细胞移植瘤以及PDX移植瘤结果说明敲低USP10可显著抑制移植瘤的生长;当我们引入YAP的激活形式YAP-5SA时可部分逆转敲低USP10抑制的移植瘤生长。(4)DEN诱导原发性肝癌发生和临床肝癌样本考察USP10-YAP/TAZ信号轴在肝癌发生发展中的作用研究:免疫组化实验结果说明USP10、YAP和TAZ的表达水平在临床肝癌样本中显著升高,且USP10的表达水平均与YAP和TAZ的表达水平呈高度正相关;DEN诱导小鼠形成原发性肝癌的实验说明USP10、YAP和TAZ在肿瘤组织中的表达丰度显著高于正常组织,提示USP10-YAP/TAZ信号轴在肝癌中发生高度激活;TCGA来源的Ualcan、Kaplan Meier和GEPIA等多种临床数据库结果显示USP10的表达水平越高,肝癌患者的预后越差,进一步分析USP10的活性与YAP/TAZ下游靶基因的表达发现USP10在临床肝癌患者中的表达与YAP/TAZ转录活性呈正相关。研究结论:USP10是直接调控YAP/TAZ蛋白的去泛素化酶。在肝癌模型中,USP10通过去泛素化调控YAP/TAZ蛋白,造成YAP/TAZ蛋白经由泛素-蛋白酶体通路降解的途径受阻,蛋白水平累积,进而促进肝癌的发生发展。抑制USP10可显著发挥体内外抗肝癌活性,而引入持续入核激活的YAP可挽救USP10敲低导致的肝癌体内外生长抑制;临床肝癌患者来源PDX进一步得到验证USP10的重要性。DEN诱导的小鼠原发肝癌组织以及临床肝癌病人肿瘤样本中,USP10均呈现显著上调,伴随着YAP/TAZ的蛋白丰度及转录活性增加,且与肝癌患者的预后生存密切相关。综上,本研究不仅发现了导致肝癌YAP/TAZ异常激活的新调控蛋白USP10,还揭示了USP10在肝癌中的重要作用,为肝癌治疗提供新靶点和新思路。