准确快速鉴定产品中的微生物种类是保障微生物肥料安全和有效的前提.传统的鉴定方法存在一些不足的地方,费时费力,有时又准确度不高,分子鉴定方法是解决微生物肥料质量检测中菌种判定难、效率低的有效途径,但目前应用仍较少.本文根据种特异性基因序列设计引物,利用聚合酶链式反应(PCR)建立一套简单、快速鉴定7种常见芽孢杆菌的方法,从而为微生物肥料产品的质量和安全性检验提供技术支持. 1.通过基因序列的同源性分析,筛选出具有种(群)特异性的基因作为PCR的靶序列.利用软件设计了枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis)、解淀粉芽孢杆菌 (B.amyloliquefaciens)、地衣芽孢杆菌 (B.licheniformis)、短小芽孢杆菌 (B.pumilus)、巨大芽孢杆菌 (B.megaterium)、蜡样群芽孢杆菌 (B.cereus group)、胶胨样群芽孢杆菌 (B.mucilaginosus group) 的引物,通过互联网比较分析得到 7 对具有种群特异性的引物.设计筛选的引物分别是:根据 rpoA 基因设计了引物B.subtilis BSL72/ BSR328,依据 gyrA 基因设计了引物 B.amyloliquefaciens L100/R836 和 B.licheniformis L168/R514,在 spoOA 基因的基础上设计的引物 B.megaterium BML257/BMR700和引物 B.cereus group L214/625,根据 16S rRNA 基因设计了引物 B.mucilaginosus group L415/R1008和引物 B.pumilus L354/R674. 2. 采用设计的种特异引物,通过优化PCR反应的退火温度、引物浓度、Mg<+>浓度等关键因子,分别建立了不同种(群)的特异PCR反应体系.经过3个属15个种的模式菌株和(或)标准菌株(共41株)的实验验证,每个反应体系在种(群)内均能扩增出目标条带,而与其他种群中无交叉反应(仅短小芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌引物与部分菌株有阳性反应),显示了良好的特异性.在灵敏度测试中,每个反应体系至少能检测到100 pg浓度的基因组DNA,而枯草芽孢杆菌和胶胨样群芽孢杆菌的敏感性达到了10pg,较高的灵敏度满足PCR鉴定和检测菌种的要求,微生物含量较低的样品中也能扩增出目标条带.PCR技术鉴定不仅可以准确鉴定不同种(群)的菌株,而且还能重新界定菌株的归属,在本文中将参考菌株CGMCC1.15、1.108、1.354 从枯草芽孢杆菌中归类至解淀粉芽孢杆菌. 3. 在单重PCR基础上分别建立了枯草群复合PCR反应体系(含四对引物)和巨大/蜡样群复合PCR体系(含两对引物),其中枯草群复合PCR反应可同时鉴定或鉴别枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和短小芽孢杆菌,巨大芽孢杆菌和蜡样群芽孢杆菌的复合PCR反应可同时鉴定或鉴别巨大芽孢杆菌和蜡样群芽孢杆菌.经过3个属15个种的模式菌株和(或)标准菌株特异性验证,复合PCR.反应具有良好的特异性和敏感性,与单重PCR特异性一致,只是灵敏度有所下降(约一个数量级),在100～1000 pg范围内,在大量、快速鉴定和鉴别枯草群和巨大/蜡样群芽孢杆菌中具有重要意义. 4. 对产品中23株枯草群菌株、10株巨大芽孢杆菌和蜡样群芽孢杆菌、10株疑似胶胨样群芽孢杆菌的基因组:DNA进行的PCR扩增结果和典型生化实验结果显示:所有枯草群菌株均有扩增产物,依据产物大小判断的菌株分类地位与生化实验结果一致,巨大和蜡样群菌株亦是如此;疑似胶胨样群菌株中有扩增产物的菌株表现典型的培养特征和菌体特征,而非胶胨样群菌株则无扩增产物,在菌落或菌体方面与其存在显著差异.因此特异PCR技术用于鉴定生产菌种准确可靠,具有良好的应用价值. 5. 通过产品特征的分析和研究,建立了产品洗涤、菌体悬浮、珠式破碎、酚-氯仿-异丙醇抽提的微生物肥料产品DNA提取方法,解决了微生物肥料中腐植质含量高难去除和芽孢难破壁的DNA提取难题.使用该方法获得的样品DNA为无色或浅棕色,大小约9Kb,经过PcR扩增,液体样品的PCR灵敏性达到10<4>-10<5>CFU/mL,固体草炭样品灵敏度达到10<7>CFU/0.2g.虽然该方法DNA损失较多,敏感性稍差,但是成本低,效率高,可直接用于PCR,为PCR方法直接检测产 6. 利用以上DNA提取技术获得16个微生物肥料产品的DNA,经过特异PCR扩增,除了两个产品中一种目标微生物含量太低(低于检测限)无扩增产物外,其他产品均有目标菌的扩增产物,根据扩增条带的大小对产品的鉴定与传统分离培养及生化鉴定结果一致,而且PCR反应的特异性没有受到产品中其他微生物的干扰.实验结果表明本文建立的种(群)特异PCR技术和DNA提取方法可用于微生物肥料产品的直接检测,在提高微生物肥料的检测水平和检测效率方面有着巨大的应用潜力. 通过大量参考菌株和生产菌株以及微生物肥料产品的试验表明:基于序列分析和种(群)特异引物的基础上建立的单重PCR和复合PCR方法,在鉴定和鉴别7个种(群)的芽孢杆菌菌株上具有快速、准确、敏感的优点,该方法不仅能够用于纯菌株的鉴定和鉴别,在含有复杂微生物群体和基质的微生物肥料产品中也具有良好的应用前景.