论文部分内容阅读
(R)-1,3-丁二醇(1,3-BDO)是一种重要光学手性醇,可用于合成氮杂环丁酮衍生物等多种医药产品重要中间体。而已报道的化学合成法存在着立体选择性不高、环境污染重等制约因素。因此,寻找一种绿色、高效的(R)-1,3-BDO合成工艺,已成为国内外研究的焦点。利用羰基还原酶不对称还原潜手性4-羟基-2-丁酮(4H2B)是制备(R)-1,3-丁二醇最有效的方法之一。本研究以构建基因工程菌生产(R)-1,3-BDO为目标,通过克隆、异源表达羰基还原酶来实现4-羟基-2-丁酮不对称还原合成(R)-1,3-丁二醇。本实验利用PCR技术克隆得到了Leifsonia aquatica(ZJB-09230)羰基还原酶的编码基因,该基因含有一个开放阅读框,全长756bp,编码251个氨基酸。二级结构预测显示该酶含有7个α螺旋和7个β折叠,相对分子质量为25 kDa,等电点为4.58。在克隆得到羰基还原酶编码基因的前提下,构建表达载体pET-28b-cr,成功转入E.coli BL21,实现目的酶的高效表达。经SDS-PAGE分析表明,重组蛋白约为25kDa,重组菌转化产物经GC-MS、手性气相色谱分析,确定为(R)-1,3-BDO,e.e.达到 99.9%。对E.coli BL21(DE3)/pET-28b-cr重组菌的产酶条件与该酶的酶学性质进行了研究。最优发酵培养基组成为(g/L):甘油10.0,酵母膏6.0,蛋白胨 7.0,K2HPO42.0,MgSO42.0,NaCl1.0,pH7.0。诱导条件:乳糖浓度7.5 g/L,诱导温度28 ℃,诱导12 h,羰基还原酶酶活达到最大值891.9 U/L,比优化前初始发酵培养条件下所产羰基还原酶的酶活(361.6 U/L)提高了 146.7%。该酶最适反应温度为35 ℃,最适反应pH为6.5,在pH 6.0～8.0之间较为稳定,辅酶依赖型为NADH。该羰基还原酶对底物4H2B和辅酶NADH的表观动力学常数:Vmax 分别为:1.74 和 4.87 μmo1/min·mg,Km分别为 1.16 和 2.96 mmo1/L。该酶对多种短链醛酮均有活性,其中对2,3-丁二酮、2-己酮的相对酶活分别达到了 2262.4%和2056.8%。Cu2+、Ag+等金属离子强烈抑制该酶活性,仅Ca2+有微弱促进作用。DTT、PMSF对羰基还原酶有保护作用,且该酶对甲醇、乙醇、二甲胺有相对较高的耐受性。本文进一步考察了重组菌催化还原4H2B的工艺,结果表明:0.2 g/mL重组菌在0.1 M,pH 8.0磷酸钾缓冲液中,添加终浓度为1.0 mM NAD+,15%(v/v)异丙醇,0.5M4H2B,40℃反应 24h后,转化率达到 77.1%,e.e.为99.9%。