目的p53基因是目前研究最广泛的抑癌基因之一，也是细胞内一个强大的转录因子，在各种应激包括DNA辐射损伤时，p53可被不同的信号通路激活，并通过增强其下游多种基因的转录而引起细胞周期阻滞、凋亡或衰老，保持细胞基因组的完整性并清除损伤细胞，对p53通路的深入研究可为肿瘤的发生发展及抗肿瘤药物的研发提供重要信息，本课题围绕p53在DNA放射损伤反应中的作用及作用机制展开了深入研究。方法本实验主要采用细胞平板克隆形成实验，计算辐射后细胞的存活率；采用胸腺嘧啶双阻滞法同步化细胞周期于G₁/S边界，再通过流式细胞仪检测细胞周期，分析p53野生型和缺失型细胞的各周期时相；采用western blotting检测细胞周期蛋白等的表达；用盐酸多柔比星处理细胞，再流式分析细胞的各个周期时相。利用慢病毒法构建p53稳定敲低及对照细胞系，并经western blotting鉴定；利用荧光素酶报告基因实验检测p53对p62/SQSTM1的转录调控作用；利用AnnexinV-FITC/PI双染法结合流式细胞仪分析电离辐射诱导的细胞凋亡情况；通过激光共聚焦免疫荧光实验和western blotting检测自噬蛋白p62/SQSTM1的表达；利用透射电镜观察细胞的自噬泡等方法。结果本实验主要获得如下结果：1. p53增强电离辐射后细胞的存活，通过克隆形成实验发现电离辐射后，HCT116p53^+/+细胞的存活率明显高于HCT116p53^-/-细胞。2.细胞受电离辐射损伤后，经流式细胞术检测发现，HCT116p53^-/-细胞G₂/M期阻滞的发生时间早于HCT116p53^+/+细胞，且G₂/M期阻滞的时间明显长于HCT116p53^+/+细胞。3. TdR双阻滞法将细胞周期同步化于G₁/S期边界后，流式细胞仪检测发现HCT116p53^-/-细胞的G₂/M期明显比HCT116p53^+/+细胞时间长。4.1μM Doxorubicin处理细胞后，流式结果发现HCT116p53^-/-细胞的S期蓄积明显比HCT116p53^+/+细胞时间长。5. Western blotting检测结果显示p53稳定敲低的A549细胞系构建成功；经荧光素酶报告基因检测显示，4Gy照射可以强烈激活p62基因启动的转录活性，在照射后2h时，其转录增加了一倍。此外，在p53^+/+细胞中，4h之后p62的转录会缓慢升高，在24h时下降，而在p53^-/-细胞中，在4h经历短暂的下降之后，随后迅速升高，直到24h还没有下降的趋势。6.对各种处理组合之后的不同时间点的细胞进行流式分析，发现正常对照细胞在照射8h左右发生G₂/M阻滞，而p53敲低细胞则在4h左右发生G₂/M阻滞，当这两种细胞在血清饥饿之后再进行照射时，G₂/M期的阻滞明显向后推迟，并且两种细胞阻滞发生时间的差异也在缩小。7.流式检测细胞凋亡结果显示，敲低p53的细胞凋亡率明显低于p53正常细胞，血清饥饿组的细胞凋亡率明显低于对照细胞，而3-MA处理组的细胞凋亡率最高。结论1， p53增强电离辐射后细胞的存活。2，细胞受电离辐射损伤后，p53可能对G₂/M期细胞检查点的激活有抑制作用，且p53可能在G₂/M期细胞转换或M期细胞的退出中发挥重要调控作用。3， p53在γ射线引起的DNA损伤反应中，主要起到抑制自吞噬的作用，并且这种抑制作用很可能是通过抑制p62蛋白的转录激活实现的。4，促进自吞噬可以促进电离辐射之后细胞的存活，而抑制自吞噬则会起到辐射增敏的作用，这种辐射增敏作用很可能是通过抑制其细胞周期阻滞来实现的。