目的烟雾吸入性肺损伤是临床上一种严重的急性呼吸系统疾病。限制于目前的治疗措施的有效性,烟雾吸入性肺损伤患者具有很高的致残率、病死率及不良预后。本研究从体内、体外实验等方面探索了大鼠骨髓间充质干细胞来源的外泌体在烟雾吸入性肺损伤中的治疗作用。方法1.采用贴壁培养法培养从SD大鼠股骨和胫骨分离的骨髓间充质干细胞。2.在显微镜下观察所培养的骨髓间充质干细胞形态,流式细胞术检测骨髓间充质干细胞表面标志蛋白CD29、CD44、CD90、CD105,造血干细胞表面标志蛋白CD34、CD45的表达。3.用外泌体提取试剂盒提取大鼠骨髓间充质干细胞外泌体,运用纳米颗粒跟踪分析（Nanoparticle Tracking Analysis,NTA）检测外泌体粒径分布,透射电镜扫描外泌体形态,蛋白质印迹法（western blot）检测外泌体表面标志蛋白CD9、CD63、CD81的表达情况。4.用自制的烟雾发生器构建SD大鼠烟雾吸入性肺损伤模型,并用提取的外泌体处理损伤大鼠,H&E染色法检测大鼠肺组织病理结构变化,TUNEL法检测肺组织凋亡变化,肺湿干比检测肺血管通透性,BCA法检测肺泡灌洗液中蛋白含量,酶联免疫吸附测定实验（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）检测肺泡灌洗液中TNF-α,IL-1β,IL-6的变化,qRT-PCR（Quantitative real-time polymerase chain reaction）及western blot检测肺组织中炎性及凋亡相关蛋白的变化。5.用自制的烟雾发生器制作烟雾培养基处理BEAS-2B和A549细胞,从而模拟烟雾吸入性损伤细胞模型,并用外泌体处理细胞。运用CCK-8法检测细胞增殖变化,LDH法检测细胞毒性,ELISA法检测细胞上清中TNF-α,IL-1β,IL-6的释放,qRT-PCR及western blot检测细胞中炎性及凋亡相关蛋白的变化。6.在烟雾损伤的细胞模型中,分别用外泌体及HMGB1过表达质粒处理BEAS-2B和A549细胞。运用CCK-8法检测细胞增殖变化,LDH法检测细胞毒性情况,ELISA法检测细胞上清中TNF-α,IL-1β,IL-6的释放,qRT-PCR及western blot检测细胞中炎性、凋亡相关蛋白及NF-κB信号通路的变化。结果1、采用贴壁培养法成功分离培养出骨髓间充质干细胞,细胞形态呈骨髓间充质干细胞特有梭形形态,且流式结果显示CD34、CD45等造血干细胞表面标志抗原阳性率均小于3%;骨髓间充质干细胞的表面标志物CD44、CD90、CD105、CD29的表达阳性率均大于90%。2、NTA检测结果显示外泌体直径主要分布于30-150nm之间,透射电镜结果显示具有清晰膜结构的囊泡,western blot结果显示外泌体表面标志蛋白CD9、CD63、CD81均有表达。综合这些结果显示所提取的为骨髓间充质干细胞来源的外泌体。3、外泌体处理后48小时的大鼠,结果显示较单纯吸入性损伤大鼠:外泌体处理的大鼠肺组织损伤明显减轻,肺组织纹理、肺泡结构更显清晰,肺间隔增厚情况及肺内出血明显改善;肺湿干比结果显示肺血管通透性明显改善;肺泡灌洗液中蛋白含量明显降低;TUNEL显示肺组织凋亡明显减轻;ELISA显示肺泡灌洗液中TNF-α,IL-1β,IL-6明显降低;qRT-PCR及western blot结果显示肺组织中炎性及凋亡相关蛋白表达明显降低。4、与单纯烟雾培养基处理的BEAS-2B和A549细胞相比,外泌体处理的烟雾损伤细胞增殖明显增强,细胞毒性减低,ELISA显示释放到细胞上清中的炎性因子减少,qRT-PCR显示炎性因子的m RNA表达水平降低,western blot显示炎性及凋亡相关蛋白的表达水平降低。5、在烟雾培养基处理BEAS-2B和A549细胞的基础上,外泌体能够抑制烟雾培养基造成的细胞增殖减弱、细胞毒性增加、炎性及凋亡因子的产生及释放;HMGB1过表达则会加重烟雾培养基所造成的影响;而外泌体能够抑制HMGB1的促炎及促凋亡作用。结论1、采用贴壁培养法成功分离培养出骨髓间充质干细胞,并成功提取、鉴定骨髓间充质干细胞来源的外泌体;2、自制的烟雾发生器成功构建SD大鼠烟雾吸入性肺损伤模型;3、骨髓间充质干细胞来源的外泌体能够有效抑制SD大鼠烟雾吸入性肺损伤;4、骨髓间充质干细胞来源的外泌体能够在BEAS-2B和A549细胞中有效抑制烟雾损伤;5、骨髓间充质干细胞来源的外泌体能够通过抑制HMGB1/NF-κB信号通路发挥烟雾损伤保护作用。