本论文主要涉及三个方面的工作。第一部分：蝎毒BmBKTx1双功能面的研究；第二部分：前体蛋白加工酶furin在胞内定位的研究：第三部分：基于组蛋白H1.2片段的furin抑制剂的研究。 1.蝎毒BmBKTx1双功能面的研究 在漫长的3.5亿年的生存选择中，蝎子逐渐进化出了形形色色，功能各异的神经活性多肽，这些多肽是它们进攻与防御的主要武器，大多作用于各类Na+和K+通道。钾离子通道是生物体中最基础的功能蛋白之一，对钾离子有高度离子选择通透性，在生理的变化过程中起着重要的作用。目前，蝎活性多肽已经成为研究K+通道的药理，生理，结构和功能特性的最有力的工具。BmBKTx1是从东亚马氏钳蝎中纯化到的一个新型短链毒素。它由31个氨基酸残基组成，含3对二硫键，与SK(低电导钙激活型钾通道)毒素的一级结构比较相似，但仅仅具有比较弱的SK阻断活性。实验表明BmBKTx1对高电导钙激活型钾通道(BK)有明显的抑制作用，同时它不具有对电压门控型钾通道(Kv)的抑制活力。BmBKTx1是第一个报道的能同时作用于BK和SK的蝎毒素，它具有一定的昆虫选择性，也是第一个能作用于果蝇BK通道(dSlo)的蝎毒素。 BmBKTx1是第一个被确认的能够同时作用于BK通道和SK通道的蝎毒素。它有可能是通过两个不同的功能面来作用于这两个通道。为了证明这个假设，本文在大肠杆菌中重组表达了BmBKTx1的野生型和它的两个突变体，K21A-Y30A和R9A-K11A，并测定了它们对蟑螂的BK通道(pSlo)和大鼠的SK2通道的阻断活性。结果表明突变体K21A-Y30A对BK通道的阻断活性有着明显的降低，但是对SK通道的阻断活性没有变化。而突变体R9A-K11A对BK通道和SK通道的阻断活性均没有变化。这些结果证实了BmBKTx1具有双功能面的假设，并且确认了它的BK功能面位于毒素C端的β折叠上。这些结果可以促进BmBKTx1在BK通道疾病的治疗，搜寻钾通道毒素，以及杀虫剂等方面的应用开发。 2. Mint3与furin相互作用调控了furin在高尔基体上的定位 多肽或蛋白质以前体形式合成后，需要前体蛋白加工酶的剪切才能获得完全的生物活性。这些前体蛋白加工酶成为生物体内重要的生理病理过程的调控者。Furin是发现得最早且功能研究最为清楚的哺乳动物前体加工酶，许多重要的生理过程需要furin的参与，如多肽与蛋白质激素的合成与分泌、膜受体的成熟、血浆蛋白前体的激活等；同时多种疾病的发生也与furin密切相关，如病毒外壳蛋白和细菌外毒素的加工活化以及肿瘤的转移等。现阶段虽然对furin的细胞内定位和自身加工成熟有较多研究，但很多具体机制和细节并不清楚。因此，对furin相互作用蛋白质的鉴定和功能分析不仅具有重要的理论意义，也有利于开发抗病毒和抗细菌外毒素的先导药物。 前体加工酶furin在细胞内分泌后，在质膜，内吞体和高尔基体(TGN)之间循环，主要分布于高尔基体。Mint3是Mint接头蛋白家族的成员，可以调控膜蛋白的运输和分泌。迄今为止，对于在furin的运输和定位过程中，mint3所起的作用仍然了解得很少。本文通过免疫共沉淀和免疫荧光共定位的实验，证明了mint3和furin可以相互作用，并且它们在HeLa细胞里共定位于高尔基体。通过RNA干扰的方法下调内源mint3的表达之后，furin的高尔基体定位被破坏，同时增加了其在内吞体中的分布。进一步的实验表明mint3通过PTB结构域(phosphotyrosine binding domain)与furin相结合，并调控了furin在高尔基体上的定位。此外，对furin进行突变发现，mint3主要通过和furin的酸性多肽信号区相互作用来调节furin的分布。我们的实验结果第一次发现，mint3通过PTB结构域与furin的酸性多肽信号区相互作用调控了furin在高尔基体上的特异性定位。这些结果阐明了一条新的furin在细胞内定位和转运的途径，提供了furin相关疾病的新的药物靶点，有利于治疗学方面的发展。 3.基于组蛋白H1.2片段的furin抑制剂的设计改造 在哺乳动物的许多生理和病理活动中，前体加工酶furin起到了非常重要的作用，例如对病毒糖蛋白和细菌毒素的激活。寻找小分子量，无毒性，高活力的furin抑制剂是解决该类疾病的非常有吸引力的药物设计途径。本文根据furin的抑制剂histone H1.2的C端片段设计和合成了一系列的短肽抑制剂。将抑制剂的活性位点替换成为furin的最佳底物识别位点，可以极大地增强抑制剂的抑制活性。在所设计的短肽抑制剂中，抑制活力最好的是一条14肽的抑制剂，对furin的抑制常数Ki达到17nM。尽管大多数合成的短肽都是可逆性的抑制剂，但是其中的一条9肽对furin有很高的稳定性，在37℃共保温3h后仍保留有全部的抑制活力。这些短肽抑制剂可以成为新的furin介导疾病的药物设计模板。