第一部分、骨髓源性血管内皮祖细胞分离、培养及分化为内皮细胞的研究　　目的:随着国内外对干细胞研究的不断深入，干细胞所介导的血管新生已成为心血管再生领域的研究热点。血管内皮祖细胞(endothelialprogenitor cells，EPCs)是其中研究最广泛、最深入的一类干细胞。骨髓是外周血循环中EPCs的主要来源，在一定条件下可得到动员并分化为成熟血管内皮细胞，参与到血管的修复或再生过程中。　　EPCs具有多种分化潜能，可以诱导分化为内皮细胞、平滑肌细胞。目前，EPCs在自体和异体移植方面都取得了一定程度的成功，EPCs分化为成熟内皮细胞后可修复血管内皮组织，加快损伤的血管再内皮化，抑制病理性内膜形成，促进心肌梗死后新生血管和侧枝循环的形成，从而从理论上起到改善高血压和治疗心肌梗死的目的。　　国外对于EPCs的实验研究已经比较深入，但国内对EPCs的研究仍处于起步阶段。内皮祖细胞主要从骨髓、脐带血及外周血中获得，外周血来源的EPCs因损伤小、易获取而被广泛使用，但所获得的EPCs纯度较低。本研究旨在探索一种有效的骨髓源性EPCs的体外分离、扩增培养、诱导分化方法，并对其形态学、组织化学及功能进行鉴定，从而为临床上进行性缺血性疾病的替代治疗奠定细胞学基础。　　方法:抽取SD大鼠骨髓细胞，采用密度梯度离心法提取骨髓液中单个核细胞，用含有血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial cell growthfactor, vEGF)、表皮细胞生长因子(epidermal growth factor, EGF)、碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor, bFGF）的培养液诱导培养EPCs，形态学观察EPCs的生长分化过程，对培养后的细胞采用免疫荧光染色鉴定细胞表面标志物，同时，根据RT-PCR法检测EPCs特异性分子标志，并进行EPCs向内皮细胞诱导分化及检测。　　结果:培养24h后细胞开始贴壁，4d后细胞呈集落样生长，细胞从集落中央向外周生长，至培养的第7d成片生长的细胞集落相互连接，10d后细胞形态明显改变，由原来的梭型逐渐缩短、变圆，类似成熟血管内皮细胞形态，呈现典型的“鹅卵石样”外观。贴壁细胞免疫荧光检测结果为CD34(+)，CD133(+)，VEGFR-2(+)，FGFR1(+)，阳性率分别为（56.23±0.18）％、(87.23±1.66)％、（90.64±0.87）％、(89.78±0.99)％。RT-PCR法检测EPCs特异性分子标志均为阳性表达。经内皮诱导液诱导10天后，细胞形态变为典型的鹅卵石样结构，免疫荧光检测CD144、CD31阳性。　　结论:采用密度梯度离心法可获得骨髓单个核细胞，在培养液中可扩增出具有典型特征的EPCs，呈贴壁增殖状态，并有分化能力，可在体外诱导分化为成熟的血管内皮细胞。　　第二部分、原发性高血压对循环中血管内皮祖细胞的影响作用　　目的:血管内皮祖细胞(endothelial progenitor cells，EPCs)多来源于骨髓，在一定条件下可以动员到外周血循环，分化为成熟的血管内皮细胞，参与血管内皮的修复和新生血管的形成。他汀类药物能够通过提高NO活性来改善内皮细胞的功能，能够起到动员EPCs的作用。　　与此相反，大量实验已证实高血压、动脉粥样硬化、血脂紊乱、糖尿病、冠心病等危险因素可降低循环内EPCs的数量和功能。而高血压可以作为一个独立的危险因素对血管内皮细胞造成损害，同时促进动脉粥样硬化的发生和发展，具有极大的危害性。　　目前，原发性高血压与EPCs的关系尚未完全研究清楚，本研究旨在探讨原发性高血压未完全控制状态下或理想控制状态下，患者外周循环内的EPCs经体外培养后在细胞数量、粘附能力、增殖能力及细胞凋亡率等方面是否存在差异。　　方法:纳入60例研究对象，其中原发性高血压患者40例，20例为血压控制未达标者，另20例为血压控制达标者，另选取20例在年龄、性别上相匹配的健康成年人为对照组。所有研究对象的血糖、血脂、基础代谢率(BMI)均在正常范围内，且无靶器官损害情况。从肘正中静脉采集研究对象外周血5 ml进行EPCs的分离、培养，1周后以乙酰化低密度脂蛋白(DiI-acLDL)和荆豆凝集素1（FITC-UEA-1）进行双染色荧光标记鉴定，在共聚焦显微镜下计数EPCs数量;以TUNEL法测算EPCs的凋亡率，同时采用MTT比色试验测定EPCs增殖能力，粘附试验检测细胞的粘附能力。　　结果:接种后的单个核细胞呈圆形，大小不一，24h后部分细胞开始贴壁，细胞变大，渐伸展，呈长梭形;培养72h后贴壁细胞明显增多，4～7d细胞生长迅速，核分裂相明显，贴壁细胞呈典型的长梭形，有的细胞首尾相连呈条索状或线状排列。第9～11天，细胞长满培养板。　　与正常对照组比较，血压控制达标组和血压控制未达标组患者在EPCs数量、增殖能力、凋亡率和黏附能力方面均有统计学差异（P＜0.05）;在EPCs数量、增殖能力和凋亡率等方面，血压控制未达标组与血压控制达标组比较均有统计学差异(P＜0.05)，但两组间的黏附能力比较无明显统计学意义(P＞0.05)。　　结论:原发性高血压患者外周血EPCs的数量减低、功能受损，从而使血管内皮细胞的修复出现障碍;待血压获得良好控制后，细胞数量和增殖能力均获得一定程度恢复，细胞凋亡率亦降低;故良好的血压控制，可增加EPCs的修复能力，最大程度维持对靶器官的保护和修复作用。　　第三部分、阿托伐他汀对高血压患者外周血内皮祖细胞数量和功能的影响　　目的:内皮祖细胞(endothelial progenitor cells，EPCs)广泛存在于骨髓、脐血、胎肝及外周血等多种组织中，参与缺血组织血管的新生、损伤内皮的修复，抑制血管内膜修复时的过度增厚。高血压作为心脑血管疾病的独立危险因素，可导致血管内皮细胞损伤，从而需要动员更多的EPCs来补充修复损伤的血管内皮。　　由于外周血循环中EPCs具有独特的血管内皮修复功能，故与高血压有关的外周血EPCs生物学研究受到越来越多专家学者的重视。从外周血中获取EPCs较骨髓、脐血更方便，且来源相对更充足，因此从外周血中分离培养EPCs成为当今研究的热点。　　他汀类药物除具有降总胆固醇、降低密度脂蛋白胆固醇、延缓动脉粥样硬化进展、抑制血小板聚集、降低C反应蛋白外，还可以改善血管内皮功能。已有研究表明，辛伐他汀类药物有促进体外培养的EPCs进行增殖的作用，同时，亦提高祖细胞的迁移能力，减少凋亡，增强细胞趋化活性。本研究通过分离服用阿托伐他汀的高血压患者外周血中的EPCs，并进行体外培养，观察阿托伐他汀对高血压患者EPCs数量是否有影响。　　方法:选取原发性高血压患者50例，随机分为常规降压药物组（常规组，n=25）和常规降压药物联合阿托伐他汀组（实验组，n=25），另选取10名年龄、性别上相匹配的健康志愿者（对照组，n=10），所有人员口服阿托伐他汀8周。分别于治疗前和治疗8周后从受试个体的肘正中静脉采集外周血10ml，进行EPCs的分离培养，在倒置相差显微镜下计数EPCs克隆数量，进而评估外周血EPCs水平。　　结果:常规组和实验组治疗8周后收缩压较前均有显著降低，组内比较差异有统计学意义(P＜0.05);常规组收缩压平均降低（32.2±7.5）mmHg，实验组平均降低(38.2±7.9) mmHg，组间比较差异具有显著性(P＜0.05)。对照组服药前后收缩压比较差异无统计学意义(P＞0.05)。服药8周后，常规组内皮祖细胞克隆形成单位(EPC-CFU)由（7.9±1.7）升高到（11.5±2.1），实验组EPC-CFU由(8.1±1.9)升高到（12.9±2.5），服药前后比较差异均有统计学意义(P＜0.05);两组EPC-CFU升高值分别为（3.6±0.6）和（4.9±0.8），具有显著性差异(P＜0.05)。对照组治疗前后EPC-CFU由（13.8±2.7）升高到(16.1±2.9)，差异有统计学意义(P＜0.05)。该组EPC-CFU平均增加数为(2.2±0.5)，与实验组比较差异具有统计学意义(P＜0.05)。　　结论:原发性高血压可引起外周血EPCs数量减低，待血压降低后EPCs数量可获得一定程度的恢复;在常规口服降压药物的基础上联合阿托伐他汀除可更好的恢复外周循环中EPCs的数量。