研究目的:在缺血性脑卒中发生后,大脑中缺血侧的细胞快速释放大量谷氨酸到细胞间隙并产生堆积,多余的谷氨酸溢出细胞间隙后作用在间隙外的谷氨酸受体上,使缺血侧的神经元处于过度激活的状态,对神经元产生兴奋性毒性作用。谷氨酸在缺血性脑损伤中具有至关重要的作用,细胞间谷氨酸清除的唯一途径是通过细胞膜上的谷氨酸转运体将谷氨酸转运到细胞内,转运到细胞内的谷氨酸在谷氨酰胺转化酶的作用下转化成谷氨酰胺,再经谷氨酰胺转运体释放到细胞间隙被神经元吸收,从而达到细胞外谷氨酸清除和转化的目的。大脑中的谷氨酸转运体有五种表现形式,不同形式的转运体表达在不同的细胞中,其中表达在星形胶质细胞上的谷氨酸转运体GLT-1,承担了细胞间约90%的谷氨酸的转运任务。然而,细胞外堆积的谷氨酸在缺血过程中是如何被调控的目前仍不是很清楚。在缺血模型中,缺血部位的神经元快速释放大量的Shh,并激活SHH通路,而该通路的过度激活也会造成神经元的丢失,与组织损伤的发生有关。在我们之前的研究工作中发现,SHH通路可以通过快速调节细胞膜上的谷氨酸转运体的表达量实现对细胞外谷氨酸浓度的快速调节,抑制SHH通路可以有效降低细胞外谷氨酸的含量,并且在这一过程发挥作用的转运体是GLT-1。因此我们的研究目的是明确在脑缺血过程中SHH通路调节GLT-1清除细胞间谷氨酸的机制,进而通过抑制SHH通路实现对缺血后的脑损伤的保护作用。研究内容:明确SHH通路对GLT-1的调节作用;找到SHH通路对GLT-1调节过程中的关键作用分子;进一步验证SHH通路在缺血过程中的作用,抑制SHH通路实现对缺血后的脑损伤的保护作用。研究方法:1.通过体外电生理全细胞膜片钳记录原代培养的星形胶质细胞膜上谷氨酸转运体的电流的方法,明确SHH通路对谷氨酸转运体的调节作用。2.通过细胞转染的方法在转染了谷氨酸转运体GLT-1的HEK293细胞中,通过细胞膜片钳记录方法明确SHH通路调节谷氨酸转运体的分子机制。3.在星形胶质细胞中通过RNA干扰的方法,实现对星形胶质细胞中分子蛋白表达的敲低,明确参与SHH通路调节谷氨酸过程中的信号分子。4.在小鼠和食蟹猴中建立MCAO模型,验证抑制SHH通路活性对缺血脑损伤的保护作用。研究结果:1)SHH通路可以通过调节星形胶质细胞膜上GLT-1的表达量来快速调节细胞外谷氨酸的浓度。2)SHH通路能够通过PKCα磷酸化GLT-1的563位点使其快速从细胞膜上转运到胞浆内。3)抑制SHH通路可以有效的改善小鼠MCAO模型后脑缺血导致的梗死面积。4)NVP-LDE225通过抑制SHH通路可以有效改善非人类灵长类MCAO模型缺血后的脑损伤,并建立短期和长期的保护作用。研究结论:SHH通路可以通过调节细胞膜上GLT-1的数量快速调节细胞外谷氨酸的浓度,而SHH信号通过激活PKCα使GLT-1上的563（562）位点的丝氨酸发生磷酸化从而降低膜上GLT-1的表达。抑制SHH信号通路能够维持膜上GLT-1的表达量,实现对细胞外谷氨酸的快速转运,从而降低细胞外谷氨酸的浓度。抑制SHH信号通路的活性可以改善缺血性脑损伤,减少缺血导致的脑梗死面积,并且能够改善缺血后的神经功能。FDA批准临床用于基底细胞癌的药物,NVP-LDE225可以通过抑制SHH通路的活性,维持细胞膜上谷氨酸转运体GLT-1的表达量,有效改善小鼠和食蟹猴缺血模型后导致的脑损伤,并且可以建立长期有效的保护作用。以上结果提示,SHH通路是降低谷氨酸兴奋性毒性,治疗缺血性脑损伤的一个有效靶点。Sonic hedgehog（Shh）作为一种有丝分裂素和形态形成素,通过Smoothened（SMO）受体介导的SHH通路在细胞增殖分化和发育过程中发挥着重要作用。胆固醇作为内源性的甾醇结构,可以直接与SMO结合来激活SHH通路。然而,SMO的内源性抑制作用的研究目前并不十分清晰。因此,在我们的研究中发现皮质醇能够直接与SMO结合,来竞争性地抑制胆固醇对SHH通路的激活作用,而消除皮质醇对SMO的抑制后,会促进肺部细胞过度增殖并导致肺发育的不成熟。Shh和胆固醇均可激活经典和非经典通路,两条途径都能够被皮质醇抑制。皮质醇和胆固醇能够在SMO上产生竞争结合。当SMO中的L112变为A112时,皮质醇不再能与胆固醇竞争结合在SMO上。Smoa/a（L116A）的突变小鼠出生后由于呼吸衰竭很快死亡,主要原因是肺间质成纤维细胞增加和表面活性蛋白的分泌减少。这些结果表明,皮质醇是SMO的内源性抑制剂,其对SMO的抑制对小鼠肺发育至关重要。